张洪英博士讲课课件。甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存、和检测

南京市疾病预防控制中心张洪英甲型H1N1流感标本的采集、运送、保存和检测1.病毒分离成功很大程度上取决于临床标本的质量，及其保存、运输等环节；2.多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物及尸检组织；3.标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存；4.常用的采样液有三种：Hank’s、Eagle’s、生理盐水；内容一、概述•依据：《流行性感冒诊断标准》ws285-2008•附录G，P295.样本要求•呼吸道样本包括：支气管肺泡灌洗液，气管抽提物、痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。6.排除标准：•未在2-4°C(≤4天)或-70°C及以下保存的样本；以上未列的其它不当样本。内容一、概述•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。•更新时间：2009年5月3日5pm，概述部分内容二、采样方法•依据：《流行性感冒诊断标准》ws285-2008•附录G，P29内容三、运送、保存标本•依据：《流行性感冒诊断标准》ws285-2008•附录G，P29内容四、血清标本•依据：《流行性感冒诊断标准》ws285-2008•附录G，P30•实验材料•试剂:•1.一步法荧光定量RT-PCR探针(例如,Taqman®)试剂盒；InvitrogenSuperScript™IIIPlatinum®一步法定量试剂盒(cat#11732-020或11745-100)；2.分子级无菌蒸馏水(无RNA酶和DNA酶)；3.正反向引物(40μM)；4.双重标记探针(10μM)；5.阳性对照。•供给:•2.实验室标记笔；2.微量离心管格栅，96孔0.2mlPCR反应管；3.20μl和200μl可调节移液器及滤芯枪头；4.0.2mlPCR反应管盘；5.光学反应盖板；6.无菌,无核酸酶的1.5ml微量离心管；7.一次性无粉手套。•仪器设备:•3.微量离心机；2.漩涡振荡器；3.实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。内容五、核酸检测（一）材料•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。•更新时间：2009年5月3日5pm，实验材料部分•操作程序•准备工作:•1.避免样品污染•由于fluorogenic5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。•推荐以下预防污染的方法：•(a)实验准备与核酸提取使用独立区域；•(b)实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；•(c)实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；•(d)不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；•(e)试剂和反应管的盖子应尽量关闭。•2.仪器准备•工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNaseAWAY®”来减小核酸交叉污染的风险内容五、核酸检测（二）程序•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。•更新时间：2009年5月3日5pm，实验材料部分•操作程序•准备工作:•3．试剂准备•注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。•（a）引物和探针•􀁺分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；•􀁺涡旋振荡引物和探针；•􀁺瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。•（b）RealtimeRT-PCR的试剂•􀁺将MasterMix和酶置于冰架上；•􀁺融化2×的ReactionMix；•􀁺颠倒混合2×的ReactionMix；•􀁺瞬时离心2×的ReactionMix和酶，置于冰架上。内容五、核酸检测（二）程序•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。•更新时间：2009年5月3日5pm，实验材料部分•操作程序•准备工作:•4．对RT-PCR的每一步过程均进行检测•1）.每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA,swFluA,SwineH1(swH1)和RNaseP(RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。•2）.对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。•3）.人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。内容五、核酸检测（二）程序•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。•更新时间：2009年5月3日5pm，实验材料部分•目的：•对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。•方法：•1、荧光定量RT-PCR；•2、一步法RT-PCR；内容五、核酸检测（三）结果判断•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》附件4内容五、核酸检测（三）结果判断1、荧光定量RT-PCR；•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》附件4内容五、核酸检测（三）结果判断1、荧光定量RT-PCR；•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》附件4内容五、核酸检测（三）结果判断1、荧光定量RT-PCR；1）.探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》附件4内容五、核酸检测（三）结果判断1、荧光定量RT-PCR；2）.在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNaseP基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNaseP都阴性，则说明：（a）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；（b）没有足够的人类细胞以备检测；（c）方法建立和实施不当；（d）试剂和仪器原因。•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》附件4内容五、核酸检测（三）结果判断1、荧光定量RT-PCR；3）.在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：（a）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。（b）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》附件4内容五、核酸检测（三）结果判断1、荧光定量RT-PCR；4）.在40个循环之前，PTC反应的InfA,swInfA,swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》附件4内容五、核酸检测（三）结果判断1、荧光定量RT-PCR；5）.当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么UnivSW和/或SWH1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。6）.在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》附件4内容五、核酸检测（三）结果判断•依据：《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心。•更新时间：2009年5月3日5pm，附件51、一步法RT-PCR；为了我们的明天更加美好！谢谢！•依据：《流行性感冒诊断标准》ws285-2008•《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》更新时间：2009年5月3日5pm，