实验四血清醋酸纤维薄膜电泳

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离目的要求（1）学习醋酸纤维素薄膜电泳原理；（2）掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白的操作技术一、电泳技术的基本原理和分类基本原理电泳：在溶液中，带电粒子在外加电场的作用下向相反电极移动的现象叫做电泳。电泳分离方法主要就是根据大分子的分子量及电性差异将大分子在电场中彼此分来的。简单的说，这些带电粒子在电泳时的迁移率，与粒子所带的电荷量成正比，与分子量大小成反比。电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两大类。前者包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。电泳类型影响电泳迁移率的因素⒈电场强度电场强度大，带电粒子的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。⒉溶液的pH值溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的带电性质及所带净电荷量。例如蛋白质分子既有酸性基团（-COOH），又有碱性基团（-NH2），当PH=PI时，蛋白质颗粒所带正负电荷相等，此时，蛋白质在电场中不再移动，当溶液pH处于等电点酸侧，即pH＜pl，则蛋白质带正电荷，在电场中向负极移动。若溶液pH处于等电点碱侧，即pH＞pl，则蛋白质带负电荷，向正极移动。溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移率越大。因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH值缓冲液。NH3+PCOOHOH–H+NH3+NH2PCOO-COO-POH–H+PH=PI兼性离子不动PH﹤PI阳离子移向负极PH﹥PI阴离子移向正极⒊溶液的离子强度电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移率的降低。而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶液的pH值，影响质点的带电量，改变泳动速度。⒋电渗在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有白蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中白蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1－、α2－、β－及γ－球蛋白。这些区带经洗脱后可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。操作方法1、准备（1）浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别光泽面和无光泽面，并在角上用笔做上记号），小心将膜有光泽面向下平放在盛有缓冲液的平皿中，浸泡5-10min左右。（2）做滤纸桥：根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒入等体积的电泳缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电泳缓冲液中。当滤纸全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上，即为滤纸桥。（已准备好）2、点样：将浸透的薄膜从缓冲液取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在干净玻璃板或不吸水的纸上（无光泽面朝上），使其底边与模板底边对齐。点样时，先在点样器上均匀地沾上血清，再将点样器轻轻地印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。点样区距阴极端1.5cm处（见图）。3．电泳：将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。通电，调节电流强度0.4－0.6mA/cm膜宽度，电泳时间约1－1.5小时。缓冲液4．染色：电泳完毕后将薄膜取下,放在染色液中浸泡3min。5．漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱净。取出薄膜放在滤纸上，用吹风机将薄膜吹干。6．结果如下：（1）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。（2）点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。注意事项（3）电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4－0.6mA/cm膜宽度。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。（4）操作过程为防止指纹污染，应戴手套。