硝酸还原酶活性的测定

硝酸还原酶活性的测定一、目的硝酸还原酶（NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO2-并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO2-的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。二、原理硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2-：NO3-+NADH+H+NRNO2-+NAD++H2O在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO2-含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下与对-氨基苯磺酸胺发生重氮反应，生成的重氮化合物又与N-萘基乙二胺盐酸盐（或α-萘胺）生成红色偶氮化合物，可在520nm下比色测定。植物对-氨基苯磺酸胺NO3-NO2-重氮化合物α-萘胺比色红色偶氮化合物520nm三、实验材料、仪器1．材料小油菜2．仪器（1）天平（2）注射器（3）试管（4）50mL三角瓶×3（5）恒温箱（6）分光光度计四、试剂1.亚硝酸钠标准溶液——5μg/mLNaNO20.1g定容至100mL，取其中2.5mL稀释定容至500mL，即为5μg/mL浓度的NaNO2标准液2.硝酸钾标准溶液——0.2mol/LKNO32.02g用磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，即为0.2mol/L的KNO3标准液3.1%对氨基苯磺酸对氨基苯磺酸1g，加浓盐酸25mL，用蒸馏水定容至100mL；共配制2次，200mL4.0.2%α-萘胺α-萘胺0.2g，加冰乙酸25mL，用蒸馏水定容至100mL；共配制2次，200mL5.30%三氯乙酸三氯乙酸30g，用蒸馏水定容至100mL五、操作步骤1．酶反应和酶活性的测定将实验材料使用打孔器打成圆片，混合均匀后分别称取2份，每份1g左右，编号后按表2加入各种试剂：三角瓶号120.2mmol/L磷酸缓冲液（mL）4.04.00.2mmol/LKNO3溶液（mL）5.05.030%三氯乙酸（mL）1.00+在针筒中进行反复抽气，直到放气后叶片变软并沉入溶液；将针筒中混合溶液和叶片取出放入编号三角瓶中，在30℃、暗条件下保温30min；取出后立即向2号瓶加入1mL30%三氯乙酸以终止酶反应。然后分别吸取上清液1mL于另一试管中，各加入2mL1%对氨基苯磺酸和2mL0.2%α-萘胺（注意顺序），室温显色30min后测定520nm波长下的光密度用2号管溶液光密度平均值减去1号管溶液的光密度，得到的值在标准曲线上查出相应的NaNO2含量（μg）2．标准曲线的制作取6支干净试管，编号，按表1加入试剂：摇匀后在室温下放置30min，然后在520nm波长下测定光密度，以亚硝酸含量和光密度值绘制标准曲线(按顺序加试剂)试管号1234565µg/mLNaNO2，mL00.20.40.60.81.0蒸馏水，mL1.00.80.60.40.201%磺胺，mL2.02.02.02.02.02.00.2%α-萘胺，mL2.02.02.02.02.02.0取样称量、编号加缓冲溶液暗处保温抽气测吸光光度值显色反应取1mL计算含量绘制亚硝酸钠标准曲线六、结果与计算把在标准曲线上查得的NaNO2含量代入下式，计算硝酸还原酶活性：NaNO2含量(µg)×稀释倍数NR活性[NaNO2(µg)/鲜重(g)·h]=样品重(g)×时间(h)七、思考题1．为什么要将加有样品和试剂的三角瓶放入真空干燥器抽气？2．为什么1号三角瓶在加入样品之前就要先加入1.0ml30%三氯乙酸？