新型高效特异抑制VZV---通过VZV编码的胸苷激酶特异识别的二环嘧啶核苷类似物(BCNAs)概要

1题目2背景2.1嘌呤核苷类似物2.11不足之处2.2嘧啶核苷类似物2.21不足之处3新型高效特异嘧啶类似物3.1背景3.2摘要3.3材料与方法3.4主要酶促反应体系3.5结果3.6讨论4出现的问题5对本实验的帮助1.SpecificRecognitionoftheBicyclicPyrimidineNucleosideAnalogs,aNewClassofHighlyPotentandSelectiveInhibitorsofVaricella-ZosterVirus(VZV),bytheVZV-EncodedThymidineKinase新型高效特异抑制VZV---通过VZV编码的胸苷激酶特异识别的二环嘧啶核苷类似物（BCNAs）1.1VZV简介水痘－带状疱疹病毒（varicella-zostervirus，VZV），在儿童初次感染引起水痘，恢复后病毒潜伏在体内，少数病人在成人后病毒再发而引起带状疱疹，故被称为水痘－带状疱疹病毒。VZV在形态上与HSV相同。仅有一个血清型。基因组有71个基因，编码67个不同蛋白，包括6种糖蛋白（gpⅠ～gpⅥ），现统一分别命名为gE、gB、gH、gI、gC和gL。在受感染的细胞中，糖蛋白gE、gB和gH极为丰富，在病毒体的胞膜中也存在这些糖蛋白。培养VZV常用人成纤维细胞以及猴的多种细胞，3天至2周左右出现典型的细胞病变，如细胞核内包涵体以及多核巨细胞的形成。病毒在细胞与细胞间扩散，再感染邻近细胞。2.1嘌呤核苷类似物代表（ACV）作用机理：在HSV、VZV和EB病毒感染的细胞中，由病毒特异性TK酶将ACV磷酸化为单磷酸化合物，而后被细胞激酶磷酸化为三磷酸化合物，与HSV-DNA多聚酶结合，掺入HSV-DNA，中止HSV-DNA链延伸，阻断病毒复制。正常细胞不能使ACV转化为单磷酸化合物，故有选择性。2.11注：这种选择性在HSV、VZV和EB中就缺乏之间的选择性。特别是对VZV-TK表现出极低的亲和力。因此为找到一种特异识别VZV-TK的核苷类似物便迫在眉急了。2.2嘧啶类似物代表BVDU•DeClercqetal.,1979主要对HSV-1和VZV有极高的选择性，机制与ACV相似，对HSV-2无作用（主要是由于其无法完成磷酸化的第二步）。•McGuiganetal.,1999,2000a,banti-VZV药BCNA作为高效特异药物进一步完善了BVDU所不能达到的效果。3.bicyclicnucleosideanalogs（BCNAs）1.表现出对HSV-1、HSV-2及任何细胞培养DNA或RNA病毒的低亲和力。2.主要修饰部位在长烷基或p-烷基苯基侧链。3.到目前为止侧链的修饰主要有末端卤素修饰、末端不饱和修饰和pyrroandthienosubstitutions。旨在阐明侧链修饰的作用及寻找一种最有效的末端修饰化合物。•3.1已有的成功例子:cf1743bearingap-pentylphenylasthesidechain,hasbeenidentifiedasthemostactiveanti-VZVcompound(EC50=0.0003uM)incellcultureandisatleast3000timesmoreactiveagainstVZVincellculturethanistheclinicallyusedACV(EC50=1uM)(McGuiganetal.,2000)3.2摘要•本研究显示出BCNAs特异的被两个连续的VZVTK磷酸化，不同于BVDU可以同时被VZV-和HSV-TK和dTMP激酶识别。•这些观察可能提供BNCAs对VZV高效识别的合理解释。3.3材料和方法•成分:BVDU,BVDU-MP,BCNA,cf1928,cf1602。核苷类似物用三氯氧磷处理在0摄氏度5H用于磷酸三乙酯的制备，反应加入0.1M碳酸氢盐终止，之后真空干燥，用硅胶柱以丙烷/水/氨水（9:2：1）进行洗脱。成分用31P核磁共振。1H核磁共振和质谱分析法进行特征分析。•放射化学：[CH3-3H]dThd(specificradioactivity（放射性比度）,52Ci/mmol)was•酶：TK-1，HSV-1TK,HSV-2TK,VZVTK,•酶促反应•色谱分析3.4主要酶促反应体系总反应体系：50ulA.50mMTrisHCl，pH8，2.5mMMgcl，10mM二硫苏糖醇，2.5mMATP,10mMNaF,10ul纯净水。将二甲亚砜加入到不同浓度的成分中，5ul中加1ugHSV-1TK或VZVTK。B.37℃孵育40min，用150ul的乙醇进行终止反应（乙醇事先用12000g，10min进行处理）C.用HPLC对BCNAs的单磷酸和二磷酸进行分离计量。D.人类红细胞提取的NDP激酶加入到VZV胸苷激酶cf1368作为测量BCNA三磷酸方法。IC50测量A.50mMTrisHCl，pH8，2.5mMMgcl，10mM二硫苏糖醇，2.5mMATP,10mMNaF,1.0mg/ml牛血清白蛋白，1uM[CH3-3H]dThd(0.1uCi),用5ul的纯净水适当的混合溶解。B，加入酶开始反应然后孵育在37℃30minC,反应加入45ulDE-81discs终止，15min后，用HCOONH4洗3次每次5min都是震荡，随即放入70%乙醇中5min。D，滤波器和放射性同位素进行含量测定。注：IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。•3.5结果•3.6讨论•无限结合能力•特异结合能力3.7•BCNAs特异的强有力结合VZV-TK进行磷酸化•对细胞溶质TK-1和线粒体TK-2无识别能力•与HSV-1和HSV-2无明显作用•细胞dTMP激酶促进BCNAs的选择性作为anti-VZV药物且对正常未感染细胞无毒副作用4.出现的问题•在HEL细胞感染VZV后仅找到5`单磷酸和5`二磷酸，并没有发现5`三磷酸的出现•(Bednarskietal.,1994;Lietal.,2000)BVOddU与BCNAs可能有相同的抗病毒机制•在酶学分析和细胞模型中并没有发现5`三磷酸的存在，这表明可能只有5`单磷酸、5`二磷酸或实验中没有发现的其他物质作用抗病毒•5.对本实验的帮助1.酶促反应基本方法2.蛋白合成基本步骤3.实验方法的借鉴4.实验思想