综合性试验蛋白质的分离提取SDS

蛋白电泳及印迹技术（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、目的与要求1.学习电泳原理和技术；2.学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术；1.电泳的基本原理带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极移动，这种现象称为电泳。生物分子所带电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量和形状的不同，在相同电场力的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，可达到分离鉴定各组分的目的。二、实验原理2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理阴离子去污剂SDS（十二烷基硫酸钠）可与蛋白质相互作用，破坏蛋白质分子的非共价键，使蛋白质变性，失去原有的空间构象，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，使各种蛋白质分子间原有的电荷差异被消除或大大降低，仅保留了分子大小的差异。蛋白质分子在电场中的迁移速度仅仅取决于各自分子的大小。当与标准分子量的蛋白质相比较，可以得出各蛋白质分子的分子量大小。3.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要丙烯酰胺纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度高，可达10-6g；(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。4.凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关分离蛋白质或核酸的分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质10420-301-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-105×1052-5核酸(RNA)10415–20104–1055-10105-2×1062-2.65.聚丙烯凝胶电泳的种类聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3图1图2夹心垂直板电泳槽及凝胶模示意图返回图2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP（过硫酸铵）催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。（1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根mclclmppmGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应(3)电荷效应A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括：凝胶孔径的不连续性缓冲液成分及pH的不连续性电位梯度的不连续性缓冲液浓缩胶样品分离胶缓冲液样品浓缩胶分离胶B.电荷效应蛋白质样品进入分离胶后pH增大(pH8.9)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。缓冲液浓缩胶分离胶C.分子筛效应分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。缓冲液浓缩胶分离胶三操作步骤㈠贮液及凝胶溶液的配制贮液及凝胶溶液的配制方法如下表。贮液及凝胶溶液的配制贮液20mL凝胶溶液混合比5%凝胶10%凝胶IⅡⅢⅣAcr30g凝胶贮液Bis0.8g加蒸馏水到100ml凝胶缓冲液SDS0.2g加0.2mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液至100mlTEMED（四甲基乙二胺）蒸馏水100g/L过硫酸铵过硫酸铵1g加蒸馏水至10ml3.33ml10ml20µl4.57ml0.1ml6.67ml10ml20µl1.23ml0.1ml（二）样品制备将蛋白质定量后溶解在含10g/LSDS、10g/L巯基乙醇的0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液中，100℃加热2～5min。蛋白质的最后浓度一般为0.05～1g/L。也可以将上述溶液在37℃保温2h而不是100℃加热。一般说来，两种处理的效果都一样。但如蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37℃处理就会引起样品水解，使测定失败，而100℃加热3min一般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况，需要采用特殊的样品处理方法。（三）电泳1.制备凝胶板（1）洗净玻璃板，将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。（2）将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。（3）用1mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。（4）倒去分离胶面的蒸馏水，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。（5）静置10min左右，上胶即可聚合，再放置10-20min，制胶完成。安装模具后入电泳装置，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。2.加样用电泳缓冲液冲洗加样孔，用微量注射器按顺序向凝胶板中加样，每孔加一种样品，各加20μl（含蛋白质10μg），同时加入标准蛋白质marker。多余的加样孔用等量的1X上样缓冲液补足。3.电泳加样完毕，正确连接电泳槽及电泳仪,打开直流稳压电源（负极接上槽，正级接下槽，事先接好），将电流调至每管8mA。保持电流强度不变，待溴酚蓝染料迁移至距下口约1cm处，停止电泳。约需1.5～2.0h。4.染色与脱色电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记；加入染色液染色1-2h，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。剥胶四.结果与计算量出加样端距电泳前沿即溴酚蓝区带中心的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下列公式计算相对迁移率mR:相对迁移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)单选题：1.SDS-PAGE电泳分离蛋白质中SDS是降低了下列哪个效应：（A）电荷效应（B）分子筛效应（C）浓缩效应答案A2.SDS-PAGE电泳在浓缩胶阶段，缓冲体系中各离子泳动速度关系下列哪个是正确的？（A）cl－protein－Gly－（B）Gly－cl－protein－(C)cl－Gly－protein－(D)protein－Gly－cl－答案A3.SDS-PAGE电泳不可用于下列哪项？（A）测定蛋白质分子量（B）分离蛋白质（C）蛋白质绝对定量（D）蛋白质鉴定答案C是非题：1.浓缩胶和分离胶中的缓冲液Tris-HCL的pH值是相同的。错2.SDS-PAGE电泳中，在相同荷电和相同形状条件下，分子量小的蛋白质分子泳动速度快。对3.SDS-PAGE电泳中，分离胶比浓缩胶的浓度低。错