免疫荧光检查

免疫荧光技术在某些皮肤病中的应用主讲人：周桂芝概述抗原与相应的抗体接触后，立即结合而形成不易分离的抗原抗体复合物。在结合之前，先使抗体（或抗原）与某些显色剂偶联，则形成的抗原抗体复合物由不可见成为可见，从而可以确定组织中是否存在某种抗原（或抗体），这就是免疫病理技术的基本原理。根据抗体（或抗原）标记物的不同分为免疫荧光技术和免疫酶标技术。免疫荧光技术的发展·1941年由Coons首先建立了免疫荧光技术·1961年由Kaskin首先将该技术应用到皮肤科·1963年Burnham等报告了红斑狼疮病人表皮、真皮间基底膜IgG、C3沉积·1964年Beutner和Jordon利用免疫荧光技术研究天疱疮·1967年区分出大疱性类天疱疮·70年代开始应用免疫电镜去认识大疱性皮肤病近来，皮肤病理工作者应用免疫荧光技术对大疱性皮肤病、红斑狼疮、扁平苔癣、银屑病、皮肤血管炎等免疫病理特征进行了研究，并已广泛应用于常规病理诊断、鉴别诊断及指导治疗。缺点：（1）标记的荧光极易褪色，不能长久保存。（2）影响荧光强度的因素很多，而且判断阳性荧光与非特异性荧光有一定的主观性。（3）阳性荧光细胞无法与常规石腊切片对照观察，组织学定位困难。（4）需要较好的冰冻切片机和荧光显微镜等，因此它的应用受到一定的限制。免疫荧光技术（一）原理：将荧光色素（异硫氰酸荧光素）与特异性抗体以化学的方法结合起来，即为荧光抗体，再用这种荧光抗体作为一种试剂，在特定的条件下浸染标本，与标本中相应的抗原结合。在组织中形成含有荧光标记的抗体—抗原复合物，再用荧光显微镜观察标本。（二）方法：1、直接法（DIF）：用荧光素标记的特异性抗体来检查未知抗原。如组织中存有相应的抗原，便结合，形成复合物。抗原标记抗体玻片标记抗原抗体复合物优点：（1）方法简单，需时短。（2）特异性强。缺点：（1）不能用已知抗原检查未知抗体。（2）为了检查各种抗原，需要准备多种特异性荧光抗体。（3）敏感性较差。2、间接法（IIF）：用荧光标记的抗体来检查未知抗原或未知抗体。抗原抗原抗体复合物未标记抗体玻片抗原抗体复合物标记抗体双抗体复合物优点：（1）既能检查未知抗原，也能检查未知抗体。（2）用一种标记抗体，能检查多种抗体复合物。（3）敏感性高。缺点：（1）由于参加的因素多，受干扰的机会也多，故结果有时判断困难。（2）方法较麻烦，时间较长。3、补体荧光抗体法：用荧光素标记的抗补体抗体检测未知抗原或未知抗体。抗原+抗体+补体复合物抗原抗体补体抗原+抗体+补体复合物抗补体标记抗体荧光标记补体复合物优点：具有间接法的一些优点。缺点：非特异性荧光更多。在皮肤病中的应用免疫荧光检查，对某些皮肤病已成为一种极重要的临床和组织学检查的补充方法，既能检查血清，又能检查活体标本。（一）标本1、血清标本：取血2ml，不加抗凝剂，室温下放置片刻，凝固离心分离出血清冷冻保存。2、皮肤活检标本：进行皮肤活检时，其所取标本部位的选择十分重要，直接关系到免疫病理的结果如何。皮肤病免疫荧光疾病活检部位沉积部位天疱疮皮损周围正常皮肤表皮细胞间IgG、C3副肿瘤天疱疮皮损周围皮肤表皮细胞间IgG、基底膜线状C3、IgGIgA天疱疮损害周围皮肤表皮细胞间IgA大疱性类天疱疮红斑损害周围皮肤基底膜线状C3、IgG瘢痕性类天疱疮损害周围皮肤基底膜线状C3、IgGEBA损害周围皮肤基底膜线状C3、IgG疾病活检部位沉积部位线状IgA大疱性皮肤病损害周围皮肤基底膜线状IgA、IgG疱疹样皮炎损害附近正常表现皮肤真皮乳头IgA、C3妊娠疱疹损害周围皮肤基底膜线状C3、偶IgG扁平苔癣类天疱疮大疱周围皮肤和扁平苔藓样损害基底膜线状IgG、C3IgG、IgM、IgA、C3胶样小体疾病活检部位沉积部位红斑狼疮皮损和正常皮肤（SLE）表皮、真皮连接处颗粒状IgG、IgM、IgASCLE皮损表皮颗粒状IgG大疱性红斑狼疮损害周围皮肤基底膜线状IgG、IgA（50%病历），表皮、真皮连接处颗粒状IgG、IgM、IgA、C3（50%病历）皮肌炎皮损表皮、真皮连接处灶性IgG、IgM、胶样小体；皮肤和肌肉血管周围IgM硬皮病皮损通常为阴性，表皮细胞核IgG，偶然（二）皮肤病1、红斑狼疮：在目前红斑狼疮的诊断和研究中，直接免疫荧光（DIF）已成为一种重要的手段。（1）狼疮带试验（LBT）：用直接免疫荧光法来确定DLE皮损，SLE皮损及正常皮肤的表皮、真皮交界处免疫球蛋白和补体的沉积。一般沉积抗体是以IgM、IgG、C3为主，IgA少，呈线状或带状或颗粒状。有时真皮内血管壁上可有IgG、IgM沉积。（2）LBT诊断价值：①LBT是诊断LE的重要检测方法，具很高的特异性，SLE皮损部位LBT阳性率为90%，未受累皮肤为54%，DLE皮损处为90%。如果LBT（+）可以确诊LE，因此能将临床上与LE相似的其他皮肤病鉴别。但是LBT（-）也不能排除LE，因LE患者的LBT不是百分之百的阳性。②LBT可用于SLE与DLE的鉴别诊断。③对无皮损的SLE，LBT有助于诊断。④LBT对SLE与其他抗核抗体阳性疾病作鉴别时，具有参考价值。⑤狼疮带假阳性。狼疮带对治疗敏感，经大约6个月治疗后，LBT可转变为阴性，（血内抗体阴转可很快，但皮损内抗体消失慢），SLE病情加重LBT由阴性转为阳性。（Ig沉积在基底细胞的半桥粒、基底板内及真皮内的纤维成份中）2、天疱疮：DIF患者几乎百分之百均可查到表皮细胞间抗体，呈鱼网状沉积，主要为IgG，约30—50%病人可有IgM、IgA。未治疗的病人伴C3。红斑型天疱疮除了在表皮出现细胞间IgG抗体外，23-80%的病人伴有基底膜抗体沉积。IIF查病人血清，约80—90%天疱疮病人有循环的抗表皮细胞间抗体，主要是IgG。病人血清中抗细胞间抗体的滴度与病情的活动性有密切关系。抗体滴度1:20—1:40为低滴度，1:80—1:160为中等滴度，1:320以上为高滴度。应每2-3周做一次IIF，直至病情减轻，以后每3—6个月复查一次。IgA天疱疮：为表皮内嗜中性细胞增多，临床表现为角层下脓疱病样皮肤病和疱疹样天疱疮，免疫病理为表皮细胞间IgA沉积，少数病人伴IgG、C3沉积。仅为细胞间IgA沉积或主要为IgA，那么IgA天疱疮诊断成立。50%的病人有循环IgA抗体结合在表皮细胞间，但滴度低。副肿瘤型天疱疮：伴恶性疾病特征，常伴肿瘤为非何杰金氏淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病、肠腺瘤等，皮损为多形性瘙痒性丘疹、鳞屑，水疱，有时似多形红斑，组织学为表皮基底层上棘层松懈，角质形成细胞坏死，角化不良，表现为天疱疮和多形红斑的特征，DIF细胞间IgG+，伴有或不伴有C3沉积，同时基底膜有C3或IgG沉积。IIF有抗表皮细胞间抗体和抗基底膜抗体。3、大疱性类天疱疮（BP）DIF在皮损周围的皮肤基底膜有线状IgG（95%），C3（100%）沉积，阳性率为95%--100%。少数病人可有IgM沉积。（沉积在透明板和基底细胞下方）IIF约70—80%病人血清中有IgG抗基底膜循环抗体。抗体滴度与病情活动性之间似无明显关系。4、疱疹样皮炎（DH）DIF非受损皮肤真皮乳头部有颗粒状IgA沉积。阳性率为95%，抗体沉积最常见为颗粒型，而连续线型少见。个别病人除IgA沉积外还伴有C3沉积。（颗粒状IgA沉积在真皮乳头弹力纤维原纤维）IIF循环抗基底膜抗体阴性。抗平滑肌肌内膜IgA循环抗体阳性（80%）。5、线状IgA大疱性皮病（LABD）DIFIgA在基底膜呈线状沉积，阳性率100%，1/3病人可有IgM、C3沉积。IIF约7—33%病人血清中有循环抗体IgA，抗原为97KD（沉积在致密板的两侧，即透明层和致密板下区）6、妊娠疱疹（HG）为在妊娠期出现的特殊类型的大疱性类天疱疮。DIF基底膜C3线状沉积，阳性率100%，约30—50%病人也可伴有基底膜IgG线状沉积。（沉积在透明层）IIF未查到循环抗体。7、获得性大疱性表皮松懈症（EBA）DIF基底膜IgG、C3沉积,阳性率100%,少数伴IgA、IgM沉积(沉积在透明层)IIF循环抗基底膜IgG抗体阳性率25—60%。(沉积在基底板下)SiteImmunoreactantDiagnosisICSIgGPV,PF,PNPICSIgAIgA,pemphigusBMZC3,IgGBP,CP,HGBMZIgG,IgA,IgM,C3EBA,bullousLE,CPBMZIgA,C3LADDermisIgA,C3DH几种大疱性皮肤病的鉴别诊断1、BP与EBA鉴别：（1）临床特征（2）免疫电镜和免疫印迹（3）盐分离皮肤法：①盐分离正常皮肤作底物，IIF，EBA抗体与真皮侧起反应，BP抗体与表皮侧起反应。②盐分离损害周围皮肤，DIF2、BP与HG鉴别：BP，70%IIF可查到IgG抗基底膜循环抗体，而大多数HG病人查不到循环抗体，HG病人血清含补体结合的循环抗BMZ抗体（又称HG因子），用IIF很难检出。3、线状IgA大疱性皮肤病与DH鉴别：线状IgA大疱性皮肤病，DIF检查基底膜处IgA线状沉积，循环抗体为IgA，而DH是真皮乳头颗粒状IgA沉积。大疱性皮肤病抗体沉积部位超微结构图图1、正常表皮基底膜超微结构图2、表皮基底膜显示自身抗体结合部位的超微结构图3、大疱性皮肤病自身抗体沉积部位及抗原分子量图4、寻常型天疱疮(DIF)图5、寻常型天疱疮(IIF)图6、IgA天疱疮(DIF)图7、大疱性类天疱疮(DIF)IgG沉积图8、大疱性类天疱疮(DIF)C3沉积图9、线状IgA大疱性皮肤病(DIF)IgA沉积图10、获得性大疱性表皮松懈症盐分离正常皮肤(IIF)IgG沉积在真皮侧图11、大疱性类天疱疮盐分离正常皮肤(IIF)IgG沉积在表皮侧图12、红斑狼疮(DIF)IgM带状沉积少见大疱性皮肤病例介绍例1患者女43岁，干部口腔溃疡，疼痛3个月。口腔双侧颊粘膜后侧及舌左侧缘表浅溃疡，左侧颊粘膜溃疡约0.5×0.3cm，未见水疱。图13图14图15例2患者男21岁农民主诉：全身反复起水疱3年，复发加重1个月现病史：3年前双足起水疱，易破溃，3天后泛发全身，用激素治疗后消退，但停药后复发，反复治疗达2年余，至5个月前停药，又复发，收入院治疗。皮肤科检查：四肢躯干广泛密集分布豆大丘疹，水疱，疱壁紧张，尼氏征（-），头皮散在淡红色斑块，躯干散在大小不一淡白色斑片，口腔粘膜（-）。病理检查：表皮下水疱，疱底真皮浅层散在嗜酸性粒细胞。胶原纤维水肿，血管扩张。DIF表皮基底膜IgG、C3强阳性沉积，IgM、IgA弱阳性。图16图17图18图19图20图21图22参考文献1、InterJDermatol1993;32(3):153-1612、Dermatologiccinic1994;12(1):133-1423、Dermatologiccinic1993;11(3):399-4184、JofCutanPathol1994;21(3):200-2065、JAmAcadDermatol1992;27(1):79-87光临