免疫血清学技术

免疫血清学技术概念：抗原与抗体在体内或体外均发生特异性结合反应，因为抗体主要来自血清，在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。一、概述按抗原抗体反应性质不同分为：凝聚性反应：凝集试验、沉淀反应标记抗体技术：荧光抗体、酶标抗体、生物素标记抗体、同位素标记抗体、其他标记抗体技术有补体参与的反应：补体结合反应、免疫粘附血凝试验中和反应：病毒中和试验、毒素中和试验免疫转印（WesternBlot）1、血清学反应的一般特点特异性与交叉性：特异性：血清学反应具有高度的特异性，如抗猪瘟病毒抗体只能与猪瘟病毒结合，不能与伪狂犬病病毒结合。交叉性：两种抗原之间含有共同抗原的时侯，有时也发生交叉反应，如伤寒沙门氏菌与霍乱沙门氏菌常发生交叉反应。抗原抗体结合机理：以非共价键结合结合力（亲和力）：抗原决定族和抗体结合点之间形成的非共价键的数量、性质、距离。结合的可逆性Ab+AgAb-Ag复合物最适比与带现象：参与反应的抗原抗体的比例反应的二阶段性：第一、抗原抗体发生特异性反应，第二、抗原抗体反应的可见阶段：凝集、沉淀、补体结合。影响反应的因素电解质、温度、酸碱度二、凝聚性试验1.凝集反应:细菌红细胞等颗粒状抗原与相应抗血清在电解质存在下,产生可见的颗粒凝集现象。直接凝集试验：玻片法：鸡白痢玻片凝集试管法：布氏杆菌试管凝集间接凝集试验：间接血凝试验：猪瘟间接血凝试验乳胶凝集试验：猪伪狂犬病乳胶凝集试验协同凝集试验：SPA+AbSPA-Ab+AgSPA-Ab-Ag2.沉淀试验：可溶性抗原（毒素、病毒、细菌裂解液）与相应抗体结合,在电解质存在情况下，产生可见的沉淀物。（1）环状沉淀反应：小口径试管中进行，先加已知血清0.1ml，然后轻轻加入等量抗原，使形成二个界面，数分钟后，二个界面间形成乳白色的沉淀环。如：炭疽环状沉淀反应:Ascoli反应（2）琼脂扩散试验：琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，高温时溶于水，冷却后凝固，形成凝胶，呈多孔结构，充满水分，允许各种抗原抗体分子自由扩散。二者于比例适当处相遇，发生沉淀，形成可见的沉淀带。包括：单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散如：马立克氏病法氏囊病的诊断（3）免疫电泳技术琼脂双扩散与电泳技术结合而成。包括：免疫电泳对流免疫电泳火箭电泳AbAbAgAg+_对流免疫电泳三、抗体标记技术Ab+AgAb-Ag(含量低时不可见)荧光素酶放射性同位素生物素-亲和素标记抗体或抗原，进行抗原抗体反应的一类技术抗体标记技术包括：荧光素标记抗体技术酶标记抗体技术生物素-亲和素标记抗体技术放射性同位素标记技术其他标记技术：胶体金标记技术标记核酸探针技术……ATGCCTTGAC…………TACGGAACTG……TACGGAACTG—放射性同位素四、补体结合反应补体结合试验（Complementfixation）：是应用蛋白质、多糖、类脂质、病毒等可溶性抗原与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可结合补体，但肉眼看不见，再加入致敏红血球，即可根据是否溶血判断抗原抗体的存在。有5个要素：抗原（待检）抗体补体红细胞溶血素（抗红细胞抗体）AgAb+CAgAb+CAgAb补体结合反应的基本原理Ag?AbCEHAg+AbCEH+不溶血Ag-AbCEHAg-AbCEH溶血五、中和试验抗原和相应抗血清按适当比例混合作用后可被中和而失去毒力，接种实验动物、组织细胞、鸡胚而不出现致病作用。1.终点法中和试验（End-pointneutralizingtest）:固定病毒稀释血清法：将已知病毒量固定（200TCID50），把血清作倍比稀释，测定血清中抗体的中和效价。固定血清稀释病毒法：将病毒原液作10倍递进稀释，分装两列试管，第一列加等量阴性血清（对照组），第二列加待检血清（中和组），混和后置37℃1h，分别接种动物（鸡胚、细胞培养），记录死亡数，用Reed法Muench计算半数致死量（LD50）。2.空班减少试验(Plaguereductiontest)：应用空斑技术使空斑数减少50%的血清量作为中和滴度。将已知空斑单位（PFU）的病毒稀释成每一接种剂量含100PFU，加等量递进稀释的血清，37℃1h。接种细胞后，覆盖琼脂，培养数天后，计算空斑数，计算血清的中和滴度。血清学反应的应用1.抗原抗体的快速检测2.生物活性物质的超微定量3.抗原抗体在细胞和亚细胞水平定位4.微生物的鉴定与分析5.血型鉴定6.妊娠诊断，检测激素水平7.内分泌的研究8.遗传育种方面的应用