第十八章_高效液相色谱法

2020/2/3第十八章高效液相色谱法一、HPLC与经典LC区别二、HPLC与GC区别三、HPLC主要类型和原理第一节HPLC主要类型与原理2020/2/3高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。2020/2/3一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1、经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1~3cm，固定相粒径100μm且不均匀；常压输送流动相；柱效低（H↑，n↓）；分析周期长；无法在线检测2、HPLC：分离和分析柱内径2~6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱）；高压输送流动相；柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩短；可以在线检测2020/2/3二、HPLC与GC区别1、分析对象差别GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2020/2/32、流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用；选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相；可以增大分离选择性2020/2/33、操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）三、HPLC主要类型和分离方法1、四类基本类型色谱法分配色谱法（partitionchromatography）吸附色谱法（adsorptionchromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）2、化学键合相色谱法（最常见常用的一种）2020/2/3化学键合相色谱采用化学键合相为固定相的液相色谱法，化学键合相是通过化学反应将有机基团键合在载体表面构成固定相固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。特点2020/2/3固定相极性流动相极性（1）正相键合相色谱：采用极性键合相为固定相，以非极性或弱极性溶剂为流动相。组分极性越大，保留时间越长正相键合相色谱极性基团丙氨基氰乙基醚和醇等分离溶于有机溶剂的极性至中等极性分子型化合物有机基团2020/2/3（2）反相键合相色谱：采用非极性键合相为固定相，以极性或弱极性溶剂为流动相反相键合相色谱固定相极性流动相极性组分极性越小，保留时间越长疏水基团C18基C8基苯基分离溶于有机溶剂的非极性或中极性化合物有机基团2020/2/3（3）键合相色谱法分离机理反相键合相色谱:常用固定相：C18（ODS）分离对象非极性中等极性化合物常用流动相甲醇-水乙睛-水反相键合相色谱疏溶剂分离机制固定相极性流动相极性2020/2/3溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力。反相键合相色谱疏溶剂分离机制反相键合相色谱保留机制——疏溶剂理论2020/2/31）溶质的分子结构（极性）极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大；引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。2）固定相键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大反相键合相色谱保留行为主要影响因素2020/2/33）流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使k增大中性盐的加入：使中性溶质的k增大pH：影响弱酸、弱减的离解流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。2020/2/3（3）键合相色谱法分离机理正相键合相色谱:常用固定相：氰基、氨基分离对象极性中等极性化合物常用流动相己烷-醇庚烷-醇固定相极性流动相极性2020/2/3分离机制？–分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解–吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用•分离选择性：–极性强的组分k大，后洗脱出柱。–流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小。2020/2/3例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水出峰顺序：苯酚，甲苯出峰顺序：甲苯，苯酚十八烷基（疏水基团）键合相二醇基（极性基团）键合相2020/2/3保留时间：例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。COOHOHOHCOOHOHOHHO没食子酸3,4-二羟基苯甲酸固定相:非极性;流动相:极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸没食子酸2020/2/3第十八章高效液相色谱法一、化学键合相色谱法固定相二、化学键合相色谱法流动相三、分离条件的选择第二节固定相和流动相选择2020/2/3一、化学键合相色谱法的固定相1、键合相的种类（1）非极性键合相：－非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面；－用于反相色谱；－长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。•固定相应符合下列要求：–颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；–化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。2020/2/3（2）弱极性键合相：醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱（3）极性键合相：常用氨基﹑氰基键合相（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)键合硅胶，一般用于正相色谱键合固定相类型疏水基团烷烃（C8和C18）、苯基等极性基团丙氨基氰乙基醚和醇等离子交换基团胺基、季铵盐磺酸、羧酸2020/2/32、键合相的性质和特点（1）键合反应–硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应如：YWG－C18H37，无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷基；SpherisorbODS，球形硅胶Spherisorb上键合了ODS。硅胶十八烷基氯硅烷ODS(C18)键合相2020/2/3（2）键合相的性质–含碳量：含碳的百分数–覆盖度：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例–封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。（3）键合相的特点–使用过程中不流失；化学稳定性好；柱效高；重现性好；适于梯度洗脱；载样量大2020/2/3•注意：流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH范围的键合相)二、化学键合相色谱法的流动相•对流动相的要求：流动相也称洗脱剂–与固定相不发生化学反应。–对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内，–与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。–纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱压，提高柱效。2020/2/31、流动相对分离的影响–n：由色谱柱（固定相）性能决定，–α：主要受溶剂种类的影响，–k：受溶剂配比的影响。2211-4nkkααR2、流动相的强度和选择性•溶剂的极性（强度）–正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强–反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强2020/2/3注意：对于非电离的溶剂，在正相色谱中溶剂的强度和极性是同义词。这样强溶剂或极性溶剂能溶解极性的溶质，并使溶质在较小的k值下流出。在反相色谱中溶剂极性和使溶质从柱内流出的能力之间的关系正好相反。如水是强溶剂，但在反相色谱中，它使溶质流出的能力是极小的，水中必须加上有机溶剂才能使溶质在反相色谱柱上在适当的k值下流出2020/2/3三、分离条件的选择1、HPLC中的速率理论–涡流扩散A=2λdp•球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相，匀浆高压填充，以降低A。–纵向扩散β=2γDm可以忽略。•因为Dm很小，室温操作，且U大于U最佳，溶剂的选择性：见图18-5–不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同混合溶剂（二元或多元流动相）2020/2/32020/2/3－传质阻抗：（引起色谱峰变宽）•固定相传质阻抗CS可以忽略，因df极小•流动相传质阻抗Cmωm因子•要求：dp小，Dm大m2PmmDdC－静态流动相传质阻抗：（引起色谱峰变宽）由于部分流动相在固定相微孔内的滞留静态流动相中再与固定相作用，传质阻抗系数CsmCsm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η要求:固定相dp2、流动相η都小2020/2/32020/2/3H=A+Cmu+Csmu–原因：化学键合相，液体流动相–结果：HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快（1ml/min）；③柱温适当。2020/2/3第十八章高效液相色谱法一、高压输液系统二、进样系统三、分离系统四、检测系统第三节高效液相色谱仪2020/2/32020/2/32020/2/32020/2/32020/2/3高压泵流动相溶剂废液色谱柱进样口检测器2020/2/3一、高压输液系统1高压泵要求输出压力高平稳、脉冲小流量稳定可调耐腐蚀2020/2/32梯度洗脱装置通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离目的得洗脱方式。梯度洗脱2020/2/3洗脱方式1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）2020/2/3等度洗脱与梯度洗脱各组分k相差较大，k大的峰宽矮，分析时间长溶解能力较强的B，各组分很快被洗脱下来，但k小的得不到分离梯度洗脱使各组分在适宜k下全部流出，峰形好时间短2020/2/3梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移分配比变化范围宽的复杂样品应采取梯度洗脱方式分离2020/2/33贮液瓶及流动相1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)适用于所选择的检测器。3)化学惰性好，以免破坏固定相。4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。对流动相溶剂的一般要求2020/2/3二、进样系统准备状态进样状态六通阀进样装置自动进样器2020/2/3三、色谱柱内径：1～6mm，柱长：5～30cm；柱填料粒径：5µm2020/2/3四、检测系统1紫外吸收检测器(a)可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器氘灯流通池测量光电二极管参比光电二极管2二极管阵列检测器2020/2/3两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器(b)(a)nm2542020/2/3紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂CS2氯仿四氢呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波长/nm3802452122101902051872020/2/3第十八章高效液相色谱法一、定性定量方法二、分离方法选择第四节HPLC分析方法2020/2/3•定性分析方法•定量分析方法：外标法、内标法同GC（自己看）一、定性定量方法固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇，线性梯度淋洗流速：1mL/min柱温：50ºC柱压：70104Pa检测器：紫外检测器稠环芳烃多为致癌物质2020/2/3二、分离方法的选择2020/2/3应用实例：外标法测定黄芩颗粒剂中黄芩苷含量，C8柱；流动相为乙腈-甲醇-水（28:18:54）；以黄芩苷对照品配成浓度范围为10.3~144.2μg/ml的对照品。进样测得黄芩苷峰面积，以峰面积和对照品浓度求得回归方程为：A=1.168×105C-1.574×103，r=0.9998。精密称取黄芩颗粒0.1255g，置于50ml容量瓶中，用70％甲醇溶解并定溶至刻度，摇匀，精密量取1ml于10ml容量瓶中，用30％甲醇定容至刻度，摇匀即得