胰岛素

胰岛素insulin糖尿病患者的春天讲员：邓羽彤组员：潘晓晓程光丽麻月芳戢菁徐婷婷讲解内容•胰岛素的简介•胰岛素的研究历史•胰岛素的分类•胰岛素的药理作用•胰岛素的生产工艺•胰岛素的存放•胰岛素的治疗•课堂互动•胰岛素的生产厂家胰岛素的简介（1）定义：胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖等得激动而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。（2）胰岛素的结构胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共16种51个氨基酸组成。其中A7（Cys）-B7（Cys）、A20（Cys）-B19（Cys）四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。不同种属的动物胰岛素分子结构大致相同，主要差别在A链第8、9、10位上的三个氨基酸及B链C端（B30）的一个氨基酸。•胰岛素的结构组成胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素(InsulinHuman)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共16种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。3D胰岛素聚合体胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer）胰岛素的分子模型（3）分泌部位（4）胰岛素的物化性质•〖英文〗Insulin〖化学本质〗蛋白质〖分子式〗C257H383N65O77S6〖分子量〗5807.69〖性状〗白色或类白色的结晶粉末〖熔点〗233℃（分解）〖比旋度〗-64°±8°(C=2,0.003mol/LNaOH)〖溶解性〗在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶；在矿酸（无机酸）或氢氧化碱溶液中易溶〖酸碱性〗两性，等电点pI5.35-5.45〖英文缩写〗INS.胰岛素的研究历史•胰岛素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现。•1922年首次从猪胰腺中提取得到，并于1923作为特效药物应用于临床治疗胰岛素依赖性糖尿病。•中国科学院肾病检测研究所主治直至80年代初，用于临床的胰岛素几乎都是从猪、牛胰脏中提取的。不同动物的胰岛素组成均有所差异，猪的与人的胰岛素结构最为相似，只有B链羧基端的一个氨基酸不同。80年代初已成功地运用遗传工程技术由微生物大量生产人的胰岛素，并已用于临床。•1955年英国F.桑格小组测定了牛胰岛素的全部氨基酸序列，开辟了人类认识蛋白质分子化学结构的道路。•1965年9月17日，中国科学家人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素，它是第一个在实验室中用人工方法合成的蛋白质。稍后美国和联邦德国的科学家也完成了类似的工作。•70年代初期，英国和中国的科学家又成功地用X射线衍射方法测定了猪胰岛素的立体结构。这些工作为深入研究胰岛素分子结构与功能关系奠定了基础。人们用化学全合成和半合成方法制备类似物，研究其结构改变对生物功能的影响；进行不同种属胰岛素的比较研究；研究异常胰岛素分子病，即由于胰岛素基因的突变使胰岛素分子中个别氨基酸改变而产生的一种分子病。这些研究对于阐明某些糖尿病的病因也具有重要的实际意义。•1920193019401950196019701980199020001923动物胰岛素1973单组分胰岛素1987人胰岛素1996胰岛素类似物1946NPH胰岛素1953长效胰岛素到1987第一支人胰岛素问世，并于同年应用于人，因为与人的天然胰岛素氨基酸序列完全相同，所以抗原性大大降低。从动物胰岛素到人胰岛素是胰岛素历史的极大进步，之后动物胰岛素时代终结。胰岛素的分类（1）按来源不同分类1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。3、生物合成人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。（2）按药效时间分类•1、超短效：注射后15分钟起作用，高峰浓度1~2小时。•2、短效(速效)：注射后30分钟起作用，高峰浓度2~4小时，持续5~8小时。•3、中效(低鱼精蛋白锌胰岛素)：注射后2~4小时起效，高峰浓度6~12小时，持续24~28小时。•4、长效(鱼精蛋白锌胰岛素)：注射后4~6小时起效，高峰浓度4~20小时，持续24~36小时。•5、预混：即将短效与中效预先混合，可一次注射，且起效快(30分钟)，持续时间长达16~20小时。•市场常见的有30%短效和70%中效预混，和短、中效各占50%的预混两种。胰岛素的作用生理作用胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。药理作用治疗糖尿病、消耗性疾病。其他功能胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入内；可促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。胰岛素在细胞中的作用：目前临床使用胰岛素的来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。胰岛素的不良反应全身反应：低血糖、过敏反应、屈光失常（视力模糊）、胰岛素性水肿局部反应：注射局部皮肤红肿、皮下脂肪萎缩或增生胰岛素抗药性使用胰岛素时的注意事项•开始胰岛素治疗后应继续坚持饮食控制和运动，指导患者进行自我血糖监测，以便于胰岛素剂量调整和预防低血糖的发生。•所有开始胰岛素治疗的患者都应该接受低血糖危险因素、症状和自救措施的教育。•胰岛素的治疗方案应模拟生理性胰岛素分泌的模式，包括基础胰岛素和餐时胰岛素两部分的补充。方案的选择应高度个体化，按照血糖达标为驱动的阶梯治疗方案，尽早控制血糖平稳达标。胰岛素制备工艺•以动物胰脏为原料提取胰岛素•----酸醇提取法•※传统胰岛素---猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶•※单峰胰岛素----凝胶过滤纯化•※单组分胰岛素---凝胶过滤、离子交换纯化•从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体•半合成胰岛素•----将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素•重组DNA技术生产人胰岛素•※AB链合成：DNA链合成分别表达AB链，化学方法连接（分别表达）•※逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素（广泛）(酶切）胰岛素的酸醇提取法猪胰刨碎37℃,2h胰腺碎块{提取}乙醇，草酸pH=2.5~3.013~15℃酸纯提取液{碱化}氨水pH=8.0~8.4酸化液盐析液{酸化}硫酸pH=3.6~3.8{浓缩}-30℃以下{去脂}速热速冷氯化钠{盐析}pH=2.0~2.5胰岛素粗制工艺流程溶液浓缩液（1）粗制：碱化液（2）精制精制品{除酸性蛋白}水，丙酮，氨水pH=4.2~4.3{锌沉淀}氨水，醋酸锌pH=6.0{除碱性蛋白，结晶}柠檬酸，醋酸锌，丙酮，氨水{洗涤}水，丙酮，乙醚干燥滤液沉淀盐析物结晶胰岛素精制工艺pH=8.0,5℃以下过滤后调pH=6.0工艺过程及控制要点（1）提取：冻胰块用刨胰机刨碎后加入2.3~2.6倍的86%~88%乙醇（质量分数）和5%草酸，在13~15℃搅拌提取3小时，离心。滤渣再用1倍量68%~70%乙醇和0.4%草酸提取2小时，离心，合并乙醇提取液，沉淀用于回收胰岛素。（2）碱化、酸化：提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH=8.0~8.5（液温10~15℃），立即进行压滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH=3.6~3.8，降温至5℃，静置时间不少于4小时，使酸性蛋白充分沉淀。（3）减压浓缩：吸取上层清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，弃去沉淀，滤液并入上清液，30℃以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液相对密度为1.04~1.06（约为原体积的1∕10~1∕9）。（4）去脂、盐析：浓缩液转入去脂锅内，在5分钟内加热至50℃后，立即用冰盐水降温至5℃静置3~4小时，分离出下层清液（脂层可回收胰岛素）。用盐酸调pH=2.3~2.5,于2.~25℃在搅拌下加入27%固体氯化钠（质量体积分数），保温静置数小时。析出的盐析物即为胰岛素粗品。（5）精制①除酸性蛋白：盐析物按干重计算，加入7倍量蒸馏水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4mol/L氨水调pH=4.2~4.3，然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为7:3.充分搅拌后，低温5℃以下放置过夜，次日在低温下离心分液，收集上清液。②锌沉淀：在上清液中加入4mol/L氨水调PH=6.2~6.4，加入3.6%（体积分数）的醋酸锌溶液，再用4mol/L氨水调节pH=6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。（6）结晶：将过滤的沉淀用冷丙酮洗涤，得干品（每千克胰脏可得0.1~0.125g干品），再按照干品质量每克加冰冷2%柠檬酸50ml、6.5%醋酸锌溶液2ml、丙酮16ml，并用冰水稀释至100ml，使充分溶解，5℃以下，用4mol/L氨水调pH=8.0，迅速过滤。滤液立即用10%柠檬酸溶液跳pH=6.0，补加丙酮，使丙酮含量为16%。慢速搅拌3~5小时使结晶析出。在显微镜下观察，外形为似正方形或斜行六面体结晶，再转入5℃左右低温室放置3~4天，使结晶完全。离心收集晶体，并小心刷去上层灰黄色无定型沉淀，用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素，效价应在26U/mg以上。（7）回收：•在上述各项操作中，应注意回收，从pH=4.2沉淀物中回收的胰岛素最多，占整个回收量的一半，约为正品的10%。从油脂盐析物中回收的胰岛素量也可以达正品的5%左右。工艺讨论（1）胰脏质量是胰岛素生产中的关键，猪胰岛素每克含胰岛素2.0~3.0U。采摘胰腺要注意保持腺体组织的完整，避免摘断。由于胰腺中含有多种酶类，离体后蛋白水解酶类能分解胰岛素使之失活。因此，要立即冷冻，先在-30℃以下急冻后转入-20℃保存备用。在胰腺中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高效率10%。（2）生产过程中浓缩的条件，对胰岛素收率影响很大。采用离心薄膜蒸发器，在第一次浓缩后，浓缩液用有机溶剂去脂，在进行第二次浓缩，被浓缩液受热时间极短，可避免胰岛素效价的损失。（3）在结晶胰岛素中，还有杂蛋白抗原成分，如胰岛素原、精氨酸胰岛素、脱酰胺胰岛素、胰多肽、胰高血糖素及肠血管活性肽等，纯度不高。采用超细SephadexG–50凝胶过滤，可使结晶胰岛素进一步纯化。重组DNA技术制造人胰岛素1.AB链合成法：以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融和基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。————已被淘汰1.反转录酶法：仿照天然合成途径通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。InsA链InsB链转化大肠杆菌发酵纯化AB链合成法:大肠杆菌生产重组胰岛素工艺流程破碎菌体包含体尿素溶解复性质粒InsmRNA反转录InscDNA转化大肠杆菌PCR连接胰岛素原活性胰岛素二硫键酶切提取质粒限制性内切酶酶切反转录酶法：酵母系统生产重组胰岛素酵母系统生产重组胰岛素•优点：二硫键的结构与位置正确，不需要复性加工处理•缺点：表达低，发酵时间长•表达载体结构基因组成：信号肽、前肽序列、MCS和微小胰岛素原。•前肽序列引导目的蛋白通过正确的