分子生物学--定点诱变与蛋白质工程课件

第九章定点诱变与蛋白质工程山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所刘贤锡蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等；天然生物材料中蛋白质含量较少；基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）；多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途;利用现代分子生物学技术，改变克隆基因中的特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适pH值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。蛋白质工程的主要技术之一是定点诱变技术.第一节定点诱变一、定点诱变的概念利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入或缺失可以使基因DNA序列中任何一个特定的碱基发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓定点诱变（sitedirectedmutagenesis）。定点诱变具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。二、基因定点诱变的意义用于研究基因的结构与功能；通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点诱变改变蛋白质生物学活性的成功例子。N端-----------笨丙-天冬-----------谷-甘--------------C端多肽链三、定点诱变的原理定点诱变原理示意图TheNobelPrizeinChemistry1993forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-basedchemistryforhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)methodforhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudiesKaryB.Mullis1/2oftheprizeUSA1/2oftheprizeCanadaMichaelSmith四、定点诱变的常用方法（一）M13DNA寡核苷酸诱变基因工程中,噬菌体是一种常用的基因载体,其中又以M13和λ为最常用。M13噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为6.4kb，在颗粒中包装的仅是正链的DNA，有时也称为感染型单链DNA(singlestrandedDNA,ssDNA)。当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把ssDNA复制为双链（dsDNA），称为复制型（replicationform,RF）M13（RF-M13）。广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（phagedisplay)和单链核酸的制备。单链丝状噬菌体(M13噬菌体)1.基本原理：寡核苷酸定点诱变技术所依据的原理是:首先制备单链核酸,即按体外DNA重组技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体上，制备此种含有目的基因的M13单链DNA，即正链DNA。再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动M13单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分。因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将其转入细胞后,经过不断复制,即可获得突变的DNA分子,再经表达即可获得改造后蛋白质.为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。2.诱变过程1)合成含有目的基因的正链DNA；2)合成含有特殊突变碱基的引物；3）制备异源双链DNA（右图）；4）富集和转化双链DNA分子；5）筛选突变体并鉴定（二）Kunkel定点诱变法体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除去,获得纯化的突变DNA。理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡核苷酸定点诱变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。因此，为了获得更多含有突变噬菌体的噬菌斑，必须提高突变体的比率。目前已有多种改良的寡核苷酸定点诱变方法，此处将Kunkel1985年建立的方法做以简单介绍。基本原理：Kunkel定点诱变法是一种通过筛除含有尿嘧啶(U)的DNA模板链进行的寡核苷酸定点诱变法。它的基本原理是:将待突变的基因克隆入RF-M13DNA载体上，导入含有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。(细胞内的dUTP酶能将细胞内的dUTP降解,使其含量减少;ung能将误入DNA新生链中的dUTP切除.在dut和ung双缺陷的大肠杆菌中,新合成的DNA链中含有U.)dut缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后以其为模板体外合成DNA的另一条链(不含U)，双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其N-尿嘧啶脱糖苷酶切去DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解。只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。Kunkel定点诱变示意图（三）PCR定点诱变PolymeraseChainReaction（PCR）是一种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化的模拟。PCR技术的原理是DNA半保留复制。Kari.B.Mullis首创。PCR原理简介Theprinciple：以待扩增的DNA分子为模板，DNA变性后，以一对分别与模板5´末端和3´末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。反应体系的基本成分—模板DNA、特异性引物、耐热性DNA聚合酶、dNTP、含Mg2+的缓冲液。包括如下基本反应步骤：①变性(denaturation:Heatto95℃tomeltstrands)，将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；②退火(annealling:Coolto55℃toannealprimerswithtemplatestrand)，将温度下降至适宜温度（55℃左右）使引物与模板DNA退火结合；③延伸(extension:ExtendprimerswithTaqpolymerase)，将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物摧化DNA的合成反应。上述三个步骤称为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25-30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。5′…..AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA.....3′3′…..TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGTCACGT..…5′变性退火(杂交)5′…..AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA…..3′ATTCGT5′引物5′AGGCTT3′….TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGTCACGT..…5′延伸5′……AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA....3′……TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT5′5′AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA….3′…..TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGTCACGT..5′5′……AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA....3′……TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT5′5′……AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA....3′ATTCGT5′5′AGGCTT……TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT5′5′……AAGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCAGTGCA....3′……TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT5′5′AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA3′……TTCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT5′5′AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA3′3′TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT5′变性退火5′AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA3′ATTCGT5′5′AGGCTT3′TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT5′延伸5′AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA3′3′TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT5′5′AGGCTTTGCCGATAGGCCATAAGCA3′3′TCCGAAACGGCTATCCGGTATTCGT5′PCR定点诱变又称为PCR寡核苷酸定点诱变，该法具有简单、快捷的特点，其基本原理及操作程序如下：①将待诱变靶基因克隆到质粒载体上，并分装到两个反应管中；②在每一个反应管中加入两种特定的引物，其中引物1和3均含有错配核苷酸，但两个引物分别与质粒DNA的不同链不完全互补，引物2和4均不含有错配核苷酸，二者分别与质粒DNA的引物1和3杂交链的互补链完全互补；③进行PCR扩增获得含有突变碱基的线型质粒DNA；④将两个反应管中的线型质粒DNA混合，再经过变性和复性，一个反应管中的一条链和另一个反映管中的互补链杂交，通过两个粘性末端形成带有缺口的环状DNA分子；⑤转化入大肠杆菌，环状DNA分子的缺口可被大肠杆菌修复。如果同一反应管中的两个互补链又互相杂交，则继续形成线状DNA分子，在大肠杆菌中不稳定，易被降解。该方法把特异突变点导入克隆基因，无需把基因插入M13中，即可在大肠杆菌中进行表达。PCR进行寡核苷酸定点诱变的示意图第二节蛋白质工程一、蛋白质工程概论基因工程诞生10周年之际著名科学家KevinM.Ulmer于1983年在SCIENCE(VOL.219)发表了论文«ProteinEngineering»,该文的摘要是:Theprospectsforproteinengineering,includingtherolesofx-raycrystallography,chemicalsynthesisofDNA,andcomputermodelingofproteinstructureandfolding,arediscussed.Itisnowpo