分子生物学常用技术

PCR技术PCR(PolymeraseChainReaction)Threesteps:denaturation,primerannealing,polymerization.ThePCRcycle•95CsteptodenaturetheduplexDNA,•Anannealingstepofaround55Ctoallowtheprimerstobind,•72Cpolymerizationstep.•Mg2+,dNTPsarerequiredinadditiontotemplate,primers,bufferandenzyme历史60s-70s：基因的体外分离技术。Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。核酸体外扩增最早设想遗忘:当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能KaryMullis(1985)发明过程Mullis在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。发展过程：开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。专利官司1987年美国专利局专利授权1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属CetusCetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家MichaelSmith共获原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。procedures•template(DNAorRNA),•primers,•Taqenzyme,•10×PCRbuffer,•Mg++,•5mmol/LdNTPs•pre-denaturation--denaturecompletely•Denaturation•annealing•Elongation•cycles:25-30PrimerdesignMostimp.(1)length:20～30bp(2)G+Ccontents:ATCGrandomdistributed(3)primers:nocomplementarysequence(4)3‘endoftheprimer:nomodification(5)5‘endoftheprimer:productlength，canbemodified(6)specificity:lessthan70%homologywithnon-specificamplificationsequence,or8bpcontinuouscomplementarybasePrimerdesignedwiththehelpofcomputerDNAdatabaseconservativeregioncomparisionprimersorblastPCRreactioncomponentsandtheirfunctionstemplate：ssDNA,dsDNAmRNAneededtobeRTascDNAsamples：fromblood,spermoranyothertissue,fromolderforensicspecimens,fromancientbiologicalsamplesorinthelab.Frombacterialcoloniesorphageplaques.DNA：verystableprimesIfthePCRproductistobecloned,itissensibletoincludethesequenceofuniquerestrictionenzymesiteswithinthe5’-endsoftheprimers.Canamplifyfragmentsover10kbinlengthStore:纯化引物在25％乙腈溶液中4℃；冻干引物于-20℃可保存1-2年，液体状态于-20℃可保存6个月。不用时应-20℃保存。buffer10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)。Mg2+：forTaqpolymeraseactivityconc.:Low:lowactivityhigh:non-specificamplificationdNTPs：贮备dNTP液：1mol/LNaOH调pH至中性。贮备浓度为5-10mmol/L，终浓度为20-200umol/L，分装-20℃保存。4种dNTP浓度应相同。TaqDNApolymerase：fromthermophilicbacteria.TaqpolymerasefromThermusaquaticus.otherthermostableDNApolymerasewithgreateraccuracyusedforcertainapplications.mineraloilSelectionforDNApolymeraseKlenow酶早期采用该酶不耐热，缺点有①温度要求低(37℃)，受热即失活；②产物特异性不高；③积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；④扩增的最长序列约400bp（Taq酶则能扩增10kb）thermostableDNApolymerases①TaqDNApolymerase②TthDNApolymerase—fromT.thermophilus③VENTDNApolymerase—fromT.litoralis④Sacpolymerase⑤pfupolymeraseTaqDNA聚合酶•分离:1969年，美国黄石国家公园温泉•分子量:94KDa•活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200000U/mgTaqDNA聚合酶离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度为50mmol/L。忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。TaqDNA聚合酶抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存:在-20℃至少6个月。PCRoptimization变性温度和时间92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55℃、1-2分钟。延伸温度和时间温度：72℃，接近Taq酶的最适75℃时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。循环次数循环过多，非特异性产物大量增加PCR污染及其对策强大扩增能力+检测的敏感性极微量的污染便可导致假阳性污染源的追踪①点样器和加样器;②离心机;③微解剖刀;④浓缩用具、真空瓶;⑤电泳装置;⑥紫外灯箱;⑦乙醇或水浴锅;⑧冰箱门把手、实验台面等污染的预防(1)隔离不同操作区(2)分装试剂(3)改进实验操作(4)专用加样器(5)结果的重演PCR技术的应用遗传性疾病地中海贫血的基因诊断血友病苯丙酮尿症传染性疾病肝炎性病肿瘤法医学个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。植物遗传育种构建遗传图谱、分离目的基因、基因定位分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化畜牧畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异DNA片段构建基因图谱检测基因整合与表达：转基因鱼其他①考古学②植物分类学③群体生态学DNA芯片技术第一小节概述一、DNA芯片技术的概念DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成（insitusynthesis）寡核苷酸探针，或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片又被称为基因芯片（genechips）、DNA阵列（DNAarray）、cDNA芯片（cDNAchips）、寡核苷酸阵列（oligonucleotidearray）等。二、DNA芯片的主要类型及其特点。根据DNA芯片的制备方式可以将其分为两大类：原位合成芯片（syntheticgenechip）采用显微光蚀刻等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片。这种芯片的集成度教高，可达10万～40万点阵/平方厘米。但合成的寡核苷酸探针长度较短，一般为8～20个核苷酸残基（nucleotide，nt），最长为50nt，因此需要使用多个相互重叠的探针片进行检测，才能对基因进行准确的鉴定。DNA微集芯片（DNAmicrochips）将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片称为DNA微集芯片，又称为DNA微集陈列（DNAmicroarray）。这类芯片集成度相对较低，可达1万～10万点阵/平方厘米，但使用的探针组的来源比较灵活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用来自基因组的较长的DNA片段；可以是双链，也可以采用单链的DNA或RNA片段，且技术实现未受到严格的专利控制，因而近年来发展很快。探针的长度可达100～500nt。第二节DNA芯片技术的基本原理与方法一、芯片的制备芯片制备的基本原理。芯片的制备包括支持物的预处理、原位合成芯片的准备和DNA微集陈列的制备三个方面。1.支持物的预处理目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分为两类：实性材料和膜性材料。实性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。实性材料需要进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基等活性基团。在合成寡核苷酸前，这些基因可与光敏材料的光敏保护基团形成共价交联而被保护起来，合成时在光照下除去光敏保护基团，该活性基团又可以和活化的单核苷酸发生化学反应。另一方面，这些活性基团可与DNA分子中的羟基等基团形成共价结合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等，使其带上正电荷吸附带负电荷的DNA探针。2.原位合成芯片的制备原位合成芯片是采用显微光蚀刻（photolithography）技术或压电打印（piezoelectricprinting）技术，在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而制成。显微光蚀刻技术也称为光引