DNA分子标记技术在酿酒酵母菌株遗传多样性分析中的应用

中国农业科学2010,43(5):1023-1030ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2010.05.018收稿日期：2009-07-23；接受日期：2009-09-25基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目（nycytx-30）、国家“863”计划专项（2007AA10Z314）作者简介：裴颖芳，硕士研究生。E-mail：[e-mail]。通信作者刘延琳，教授，博士。E-mail：[e-mail]分子标记技术在酿酒酵母菌株遗传多样性分析中的应用裴颖芳，刘延琳（西北农林科技大学葡萄酒学院/陕西省葡萄-葡萄酒工程中心，陕西杨凌712100）摘要：本文介绍了RAPD、mtDNA-RFLP、微卫星DNA（microsatellite）、Interdelta指纹图谱以及线粒体DNACOX1基因指纹图谱等5种DNA分子标记技术的方法和原理及其优缺点，同时探讨了DNA分子标记技术在国内外酿酒酵母菌株区分中的应用状况与前景。关键词：酿酒酵母菌株；RAPD；mtDNA-RFLP；interdelta指纹图谱；COX1基因；微卫星DNAApplicationofDNAMolecularMarkersinGeneticDiversitiesofSaccharomycescerevisiaeStrainsPEIYing-fang,LIUYan-lin(CollegeofEnology,NorthwestSci-TechUniversityofAgricultureandForestry/ShaanxiEngineeringResearchCenterforViti-Viniculture,Yangling712100,Shannxi)Abstract:ThebasicprinciplesofthemethodsconcerningfiveDNAmolecularmarkersincludingrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD),fragmentlengthpolymorphismofmitochondrialDNA(mtDNA-RFLP),microsatelliteDNA,interdeltafingerprintingandmtDNACOX1genefingerprintingwereintroducedinthispaper，includingillustrationofboththeadvantagesandthedisadvantagesofeachmethod.Besides,theapplicationandprospectoftheseDNAmolecularmarkersindifferentiationofSaccharomycescerevisiaestrainswerediscussedandreviewed.Keywords:Saccharomycescerevisiaestrains;RAPD;mtDNA-RFLP;interdeltafingerprinting;COX1gene;micro-satelliteDNA0引言遗传标记（geneticmarkers）在种质资源的遗传多样性研究和育种工作中有着十分重要的地位。目前，应用较为广泛的遗传标记有形态标记（morphologicalmarkers）、细胞标记（cytologicalmarkers）、生化标记（biologicalmarkers）和分子标记（molecularmarkers）[1]。前3种标记都是对基因表达结果的间接反映，标记数目有限，多态性较差，易受环境条件的影响[2]。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是DNA水平遗传变异的直接反映。DNA分子标记不受环境与基因表达与否的限制，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定[3]。所以，DNA分子标记从它诞生之日起，就引起了生物科学家极大的兴趣，在酿酒酵母菌株的遗传多样性研究中也发挥着重要作用，成为国外近年来的研究热点。酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）广泛应用于食品发酵[4-8]、医药[9]和环保[10]等领域。在工业生产的纯种发酵时代，要求能在菌株水平实现发酵的微生物学控制，如在食品发酵中，为了监测酿酒酵母菌株变化[11-13]，在医药中，为了确保酿酒酵母菌种种质的纯度[9,14]，在葡萄酒酿造中，发酵过程的微生物学监控、发酵优势菌的检测、不同地理起源的酿酒酵母菌株的甄别等，都需要进行酿酒酵母菌株区分[15-17]，通过菌株区分而揭示其遗传多样性。常规的遗传和生理生化手段难以达到菌株水平的区分，必须借助于DNA分子标记方法来完成。目前，应用于酿酒酵母菌株区分的昀广泛、昀有应用前景的DNA分子标记技术有：随机扩增多态性DNA标记法（RAPD）[18-23]、线粒体DNA限制性片段长度多态性分析（mtDNA-1024中国农业科学43卷RFLP）[24-26]、微卫星DNA标记法[27-31]、Interdelta指纹图谱法[32-37]以及COX1基因指纹图谱法等[38]。本文介绍这几种DNA分子标记方法的原理及优缺点，并探讨其在酿酒酵母菌株区分中的应用状况与前景。1RAPD标记法RAPD技术是1990年由美国科学家Williams在PCR技术的基础上发展起来的。RAPD采用随机的寡聚核苷酸为引物，以不同菌株的基因组DNA内的核苷酸序列的不同，通过PCR扩增反应，产生不同的PCR扩增产物，显示出不同菌株之间的差异，因此可以应用于酿酒酵母的分类分型[39]。由于其可检测到生物体的整个基因组DNA，大大简化了技术过程和工作强度，在菌种的鉴定、基因遗传图谱制作、数量性状基因研究、自然群体中遗传变异及种间杂交的研究、流行病学调查和菌株鉴别上均发挥了重要的作用[13,19,40-44]。1.1RAPD技术在酿酒酵母菌株区分中的应用Martinez等[45]为了确保所获得酵母单菌落的地方性遗传背景，利用RAPD、mtDNA-RFLP以及脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE）分析本土酿酒酵母单菌落的地理起源和遗传多样性，在RAPD技术中，采用27个引物进行了酿酒酵母单菌落的区分，发现大多数酿酒酵母单菌落与其地理起源有很高的相关性，同地理起源的酿酒酵母单菌落间的平均相似系数为0.7，是3种方法中获得相似值昀高的，认为RAPD技术具有更强的菌株区分能力。Romano等[46]利用RAPD技术对分离自意大利葡萄园不同葡萄品种的酿酒酵母单菌落进行菌株区分，80个野生酿酒酵母单菌落中被区分为12种不同的基因型，即12株不同的酿酒酵母菌株，用这些遗传背景不同的菌株进行发酵试验，可以更高效地获得对葡萄酒质量有突出贡献的优良菌株。徐勇等[47]对6个属的21个酵母菌株的基因组DNA的多态性进行了RAPD分析，研究表明，RAPD能够检测出酵母种内微小的遗传差异，其特征谱带可作为酵母菌种鉴定的特征标记。1.2RAPD优缺点RAPD技术优点：①速度快、成本低，在较短时间内可分析大量样本，既省时又省力；②RAPD多态性灵敏度高，可检测到单个碱基的置换；③设计引物时不需预先知道模板的序列信息；④DNA用量少，随机引物可从生物技术公司低价购置等。但是，由于RAPD技术本身的原因如引物较短、复性温度较低，因而重复性及特异性较低，对反应中的许多因素的变化敏感[47]。另外，引物的筛选和反应条件的优化也往往需要花费较多的时间。2mtDNA-RFLP分析线粒体DNA限制性片段长度多态性分析（mtDNA-RFLP）是利用不种或同种生物的线粒体DNA经限制性内切酶消化，产生大量的、分子量不等的DNA片段，利用凝胶电泳技术分离被酶解的DNA片段后，产生不同的条带，进行差异性分析，从而将不同菌株区分开[24-25]。由于mtDNA较小，适于进行限制性酶切分析，而且不同的菌株具有一定的mtDNA限制性酶切图谱[48]。2.1mtDNA-RFLP在酿酒酵母菌株区分中的应用国外的一些葡萄酒厂已将mtDNA-RFLP技术引入到葡萄酒的发酵控制[24-25]。通过对发酵过程中酿酒酵母的菌株区分，揭示发酵过程中酿酒酵母菌株的生态变化和多样性。González等[49]对来自不同样品的1307个酿酒酵母单菌落进行了mtDNAHinf1酶切分析，得到47株不同的酿酒酵母菌株，每个菌株中包含1—10个酿酒酵母单菌落。同时发现这47株酿酒酵母中，在葡萄汁只发现2个菌株，而在发酵中期，这47株酿酒酵母菌株都存在，在发酵末期，只有部分菌株存在。Agnolucci等[50]用Rsa1酶对S.bayanus、S.pastorianus和S.cerevisiae菌株mtDNA进行酶切分析时，发现其图谱间的相似性为20%，证明mtDNA-RFLP标记法能够区分同种菌株。Lopes等[24]利用mtDNA-RFLP和killerbiotype分析法，对来自阿根廷Patagonia地区不同品种葡萄自然发酵过程中分离的112个本土酿酒酵母单菌落进行了菌株区分，发现这112个本土酿酒酵母单菌落中mtDNA-RFLP产生37种不同的酶切图谱，而killerbiotype法只产生了19种不同图谱，结合两种分析法，在112个酿酒酵母单菌落总共有42个酿酒酵母菌株，同时也说明mtDNA-RFLP具有更强的菌株区分能力。较多的研究表明[18-19,24-26,49]，mtDNA-RFLP具有同脉冲电泳核型分析（PFGE）相同或相当的菌株鉴别能力，所以近些年来，mtDNA-RFLP分析法已逐渐取代了PFGE在酵母菌株区分上的经典地位。2.2mtDNA-RFLP的优缺点优点[51-53]：①方法较为简便；②影响因子少；③稳定性高；④背景清楚。但是，在实际工作中，往往要反复进行酶切，才可能获得满意的谱带，造成时间5期裴颖芳等：DNA分子标记技术在酿酒酵母菌株遗传多样性分析中的应用1025的延误和成本的增加。3微卫星DNA分子标记法微卫星指“短DNA序列的重复”，也被称为“简单重复序列（simplesequencerepeats,SSRs）”，其串联重复的核心序列为1—6bp，其中昀常见的是双核苷酸重复，多为（CA）n或（TG）n重复，也有一些微卫星重复单位为3个核苷酸，极少数为4个核苷酸或更多[27,29]。值得注意的是，并不是所有的微卫星都严格按照重复单位的碱基组成串联重复，这种重复可能被另外一些核苷酸所打断，形成不完整的微卫星[31]。这可能是由于碱基的替换、错配及不均等交换所致[54-55]。微卫星DNA由于核心序列重复次数的不同以及重复程度的不同而造成了每个座位的多态性，这种多态性的信息量丰富。微卫星位点是由微卫星的核心序列与其两侧的侧翼序列构成。侧翼序列使微卫星位点具有特异性，微卫星DNA本身重复单位数的变异是形成微卫星位点多态性的基础，多态性常表现为复等位性。其原理是：根据微卫星序列两端的互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据分离片段的多态性来区分不同的菌株[31]。3.1微卫星DNA标记在酿酒酵母菌株区分中的应用在葡萄牙，Schuller等[56]从自然发酵的葡萄汁中分离鉴定出361株酿酒酵母单菌落，用6个微卫星引物进行PCR扩增与mtDNA限制性酶切分析，结果表明S.cerevisiae和S.bayanus是葡萄酒发酵过程中的优势菌株。Laitila等[57]利用微卫星引物M13对麦芽糖生产过程中分离的700株酵母单菌落进行MSP-PCR指纹分析，经初步归类后鉴定出25种子囊菌酵母和18种担子菌酵母。Dorit等[27]研究利比里亚极端酸性环境中的酵母菌，利用微卫星引物M13对分离的207株S.Domingos和58株R.Tinto酵母进行MSP-PCR指纹分析，并把代表性菌