DNA芯片技术在动物医学中的应用研究进展

0引言传统分子生物学技术通常只能同时对少数几个基因的表达情况进行研究。决定生物形态或某种生物现象通常是成百上千的基因共同作用的结果，作为一种能够获得大量基因表达图谱的高通量技术，DNA芯片应运而生。DNA芯片也称基因芯片(GeneChip)、生物芯片(BioChip)或微阵列(Microarray)，其概念最早由美国Affymetrix公司提出，它是将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于载体上，再与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获得样品分子的数量和序列信息[1-2]。DNA芯片技术融合了生命科学、化学、微电子学、计算机科学、统计学和生物信息学等诸多学科领域的成就，具有快速、高效、大规模、高容量、高度并行性等特点[3]。近年来，各学科的相关DNA芯片相继问世，已经产生了令人瞩目的社会效益和经济效益[4-5]。1DNA芯片技术的原理DNA芯片是分子杂交方法的扩展，与传统的核酸基金项目：国家自然科学基金资助项目(30700597)。第一作者简介：马艳平，女，1984年出生，硕士，汉族，山东宁津县人，主要从事病毒分子生物学和免疫学研究。通信地址：730046甘肃省兰州市城关区徐家坪1号。通讯作者：刘永生，男，1973年出生，博士，汉族，副研究员，主要从事动物病毒病分子生物学研究。通信地址：730046甘肃省兰州市城关区徐家坪1号，Fax：[phone]，E-mail：[e-mail]。收稿日期：2010-02-21，修回日期：2010-03-21。DNA芯片技术在动物医学中的应用研究进展马艳平，陈豪泰，马丽娜，周建华，张杰，丁耀忠，王猛，刘文倩，刘永生（中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室，兰州730046）摘要：随着基因组数据的增长，DNA芯片(DNAChip)技术得到广泛应用。其集成化、微型化、自动化的优点，为生物、医学、化学等领域的研究提供了一个强有力的工具，笔者从基因表达谱研究、病原微生物检测、细菌分型、基因突变和多态性检测、病原微生物基因组学研究多个方面概述了DNA芯片技术在动物医学中的应用进展、并对DNA芯片技术的原理和分类进行综述。关键词：DNA芯片；动物医学；原理；应用；分类中图分类号：S858.28文献标志码：B论文编号：2010-0474ResearchProgressonApplicationofDNAChipinAnimalMedicineMaYanping,ChenHaotai,MaLina,ZhouJianhuan,ZhangJie,DingYaozhong,WangMeng,LiuWenqian,LiuYongsheng(StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,KeyLaboratoryofAnimalVirologyofMinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofVeterinaryPublicHealthofMinistryofAgriculture,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046)Abstract:Withtheincreaseofgenome’snumbers,DNAChiptechnologygainedwidelyapplication.Itsmeritofintegration,miniaturization,andautomationadvantagessupplyapowerfultoolinthefieldofbiology,medicine,chemistryandotherresearch.ThisarticleoverviewDNAchiptechnologyfromgeneexpressionspectrumresearch,identificationofpathogenicmicrobialdetection,bacterialtyping,geneticmutationsandpolymorphismdetection,pathogenicmicrobialgenomicsresearchinanimalmedicineapplicationprogress,andtheprincipleofDNAchiptechnologyarereviewed.Keywords:DNAChip;animalmedicine;principle;application;classification中国农学通报2010,26(14):27-30ChineseAgriculturalScienceBulletin中国农学通报印迹(Southernblot)方法基本相似，其基本原理是利用DNA双螺旋序列的互补性，即两条寡聚核苷酸链以碱基之间形成氢键配对原则[6]，DNA芯片通常以尼龙膜、玻璃、塑料、硅片等为基质材料，大约1cm2面积的载体上，点布数以万计不同的寡核苷酸或cDNA，将芯片与标记有生物素或荧光染料标记的待测DNA、RNA或寡核苷酸杂交，与靶序列配合好的探针会产生强烈的杂交信号，如果有碱基错配信号就会减弱。然后用放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描，对杂交结果进行计算机软件分析，获得杂交信号的强度及分布模式图，以此反映出所检测的样本中有关基因的表达强弱，可推算每个探针对应的样品量。一张DNA芯片，可固定成千上万个探针，具体数目则取决于芯片设计和制备方法。DNA芯片操作的简单步骤概括为支持物的处理；探针的制备；点样；样品的制备；样品的标记；样品的杂交；杂交结果的检测[7-9]。2DNA芯片的种类2.1按载体材料分类按照DNA芯片所采用的载体材料将其分为硅芯片、陶瓷芯片、玻璃芯片、聚丙烯膜芯片和尼龙膜芯片等。2.2按点样方式分类根据DNA芯片点样方式的不同，可将其分为原位合成芯片、微矩阵芯片和电定位芯片。2.3按探针种类分类按照固相载体上所点DNA的种类不同，芯片可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片2种。2.3.1寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片一般以原位合成等方式固定到载体上，具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，特异性差，并且随长度的增加，合成错误率随之增高，寡核苷酸芯片也可通过直接点样制备，但固定率不如cDNA芯片高。寡核苷酸芯片主要用于点突变、测序和表达谱研究[10]。2.3.2cDNA芯片cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等固相载体上按矩阵密集排列并固化，基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张玻璃片60000个基因。cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好[11]。2.4按用途分类按照基因芯片的用途可将芯片分为表达谱芯片、序列检测芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、毒理芯片等。表达谱芯片是日前比较成熟、应用最广泛的一种基因芯片，主要用于检测基因的差异性表达、寻找新基因和研究基因功能[12]；序列检测芯片广泛用于各种特定基因序列的检测、基因突变和单核首酸多态性检测、基因测序[13]。3DNA芯片在动物医学中的应用DNA芯片作为分子生物学上的一个重要的技术突破，在许多领域内得到了应用，随着DNA芯片在生物学研究的不断深入，它将在未来的几年甚至几十年间成为研究领域的主角。3.1基因表达谱研究的应用就DNA芯片而言，基因表达谱研究是目前研究最多、应用最为成熟的领域。由于在芯片上可以固定成千上万的探针，这使得众多基因的同时检测成为可能[12]。我们可以对比在不同条件一个基因组中大量基因的转录水平差异，也可以对比不同基因组中对应基因的转录水平差异；这一特点从根本上突破了以前基因研究中一次只能关注一个或几个基因的瓶颈，极大地推动了病原微生物相关研究的进展。Helmann等[14]研究了热休克状态下枯草芽孢杆菌的表达谱，发现100多个上调基因，大部分是一个由sigmaB因子控制的通用压力反应调控子的成员，其他则受HrcB或CstB热休克调控子控制；同时通过对受控基因相邻基因的序列分析，预测了70个新的SigmaB因子调控子成员。Zheng等[15]研究了大肠杆菌的过氧化氢应激表达谱，通过比较野生型和OxyR基因缺失突变体的表达谱差异，证实了大部分过氧化氢诱导表达基因受过氧化物调节因子OxyR调控，同时还确定了几个新的OxyR激活基因，包括hemH亚铁血红素基因等；此外由于有些基因的诱导是OxyR非依赖型的，提示在大肠杆菌中存在其它的过氧化氢传感器和调节因子。3.2病原微生物检测的应用利用DNA芯片进行疾病诊断是目前芯片在医学中的主要应用之一。针对各种病原体制作的诊断DNA芯片已开始商品化。目前人医上DNA芯片应用广泛，HIV芯片可检测是否携带艾滋病病毒[16]。而在动物医学上，尚未形成一定规模的商品化，目前正在试验阶段，杨素等[17]利用动物病毒的一段高度保守的基因片段，用芯片点样到包被过的玻璃片上，制备成检测芯片，提取动物病变样品的DNA或RNA，进行荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交，对杂交结果进行扫描检测，可同时诊断多种动物传染病，此方法不但快速、准确、敏感，而且可同时进行多种病毒的检测，达到大批动物高通量检疫的目的。··283.3细菌分型的应用利用基因芯片技术对致病菌基因组DNA、rRNA进行遗传分析，从而能够计算出细菌种属间的遗传距离或者分析和判断菌体的毒性等。Dorrell等[18]建立了一张弯曲菌基因组芯片，与不同的致病菌基因组DNA杂交，结果显示被检测的11种致病菌基因组DNA中21%基因没有杂交信号，说明这些基因在被检细菌基因组中存在高度的差异性。Borucki等[19]建立了一种基因组芯片鉴定不同血清型的单增李氏菌，可以清晰地将24种单增李氏菌区分为两种类型。这种方法非常适用于寻找致病菌与非致病菌之间的差异基因，通过对杂交结果的分析，高通量地筛选出多种差异基因，该技术还可以对更大规模的基因进行筛选，可以应用到细菌致病分子机制等基础研究中。3.4基因突变和多态性检测的应用DNA芯片在核酸点突变检测以及序列测定中显示强大功能。将DNA芯片技术用于检测分子突变，能准确地确定突变位点和突变类型，检测多个基因乃至整个基因组的突变，王永忠等[20]应用DNA芯片法检测乙肝病毒的位点突变，实验结果显示，HBsAg+、HBeAg+、HBeAb-的患者病毒没有变异；HBsAg+、HBeAg+、HBeAb+的患者HBV前C区1896位、BCP区1762、1764位变异较多；HBsAg+、HBeAg+、HBeAb+的患者HBV前C区1896位变异低于“小三阳”患者，而BCP区1762、1764全部发生了变异。接受拉米夫定治疗48周后HBVDNA阳性患者中，HBVP区基因变异较多，实验结果表明，DNA芯片法用于乙型肝炎病毒基因突变分析，简便、快速、特异性好。3.5病原微生物基因组学研究的应用随着越来越多的微生物基因组序列的公布，比较基因组学研究逐渐成为微生物研究的热点。比较基因组学研究可以提供非常丰富的信息，指导后续的功能基因验证等工作。例如，比较同一个致病菌致病力不同菌株的基因组序列，可以推断出一些与致病力密切相关的基因；比较极端环境下生长的细菌与其近缘细菌的基因组序列，能为揭示极端微生物特殊表型的分子基础提供重要线索；而通过基因组序列比较，分析一些近缘细菌或同一细菌不同菌株间基因的缺失及获得，可以得到有益的进化信息[21]。但是毕竟进行全基因组测序耗资巨大，利用已经公布的细菌全基因组序列，制备涵盖全部ORF的DNA芯片，可以在很大程度上满足全基因组比较的需要。将4株荧光假单胞菌的基因组片段化后，取60~96个