一种治疗奶牛乳房炎的生物免疫活性因子的研发推广

一种治疗奶牛乳房炎的生物制剂的研发与推广项目编号：07A01主要内容一、选题依据二、材料（略）三、方法与技术路线四、结果与分析五、讨论六、结论一、选题依据•奶牛乳房炎是一种危害极其严重的接触性传染病该病主要由病原微生物感染而引起。是一种能够导致奶牛业最为严重经济损失的疾病。根据其有无临床症状可以将奶牛乳房炎分为临床乳房炎和隐性乳房炎两类，其发病率根据统计可高达70%，就连国外一些饲养条件和卫生条件良好的奶牛场中乳区感染率高达75%。目前全世界约有2.2亿头奶牛，其中约有1/3的奶牛患各种类型的乳房炎。美国每年因奶牛乳房炎造成的损失达20亿美元。全球每年因乳房炎引起的损失达到350亿美。现阶段控制奶牛乳房炎困境•常用抗生素疗法的缺陷目前对于奶牛乳房炎的治疗主要是抗生素疗法。利用抗生素控制侵入机体的病原微生物，这种方法的利用，在控制乳房炎、降低乳房炎的发病率方面,特别是在控制急性、多发性和亚急性乳房炎方面起到积极的作用。但是，由于抗生素疗法疗程较长，抗生素被大量应用，致使一些常见病原菌产生抗药性，耐药菌株大量出现，使得常用药物疗效下降；同时，大量使用抗生素后，乳汁中有大量抗生素的残留，直接影响到酸奶的制备，并可能出现耐药质粒的传递和转移，危害人类的健康。抗生素疗法无法对遭受到病原微生物破坏的乳腺细胞进行有效的修复，即使治愈了乳房炎，也无法使奶牛产奶量得到恢复，而乳房炎引起的损失的70%来自于各种奶牛乳房炎引起的产奶量下降。现阶段控制奶牛乳房炎发展方向非抗生素疗法的发展为克服抗生素疗法的缺点，发展出以下多种控制方法，包括环境控制法、营养疗法、物理疗法、生物疗法。这些方法各有优缺点，免疫因子疗法由于免疫因子的固有可调节免疫的特点是其中非常具有发展前途的疗法。免疫因子治疗乳房炎的原理1.免疫活性因子能够促进乳腺内细胞MHCII类分子表达，促进抗原递呈和免疫应答2.免疫活性因子增强乳腺中巨噬细胞、嗜中性粒细胞的吞噬力和杀菌力3.免疫活性因子促进免疫细胞增殖分化，提高细胞毒作用，促进乳腺免疫应答4.免疫活性因子对炎症介质进行调控，从而控制乳房的炎症过程本次实验就是基于免疫活性因子的这些特点将其应用于乳房炎的治疗之中，以其达到良好的疗效。研究意义本次实验期望通过经济、来源可靠的原料制备免疫活性因子，建立起检测其生物活性的有效方法，测定生物安全性。并将之应用于临床，验证其疗效、残留和对产奶量的影响。最终的目的在于研制一种经济、有效、安全的牛乳房炎免疫治疗药物。二、材料（略）三、技术路线•1.免疫活性因子的制备及其安全性和活性检验（实验室进行）•2.免疫活性因子对奶牛乳房炎的临床治疗试验（临床试验推广）免疫活性因子的制备和检验•透析法制备免疫活性因子•理化性质检验•安全性检验：毒性检验、热源检验•免疫活性因子对外周血白细胞数量、吞噬功能及免疫器官重量的影响免疫活性因子对奶牛乳房炎的临床治疗试验1.用药种类及给药方法分类2.效果分析免疫活性因子制备流程原材料挑选清洗处理剪碎匀浆反复冻融调整Ph值过滤超滤无菌检验灌装动物实验透析用药种类及给药方法分类•表1**奶牛厂用药种类及给药方法组别数量患病乳区数用药种类及给药方法A11248抗生素★A21247抗生素☆A31243抗生素★+活性肽★A41245抗生素★+活性肽☆A51247抗生素☆+活性肽★A61247活性肽☆A71246活性肽★表2****奶牛场用药种类及给药方法•表中“★”为肌肉注射、“☆”为乳房灌注；用药剂量为抗生素每个患病乳区200mg，肌肉注射量为四个乳区用药剂量之和，患病乳区不足四个的，按照四个乳区用药量给药。组别数量患病乳区数用药种类及给药方法B11243抗生素★B21247抗生素☆B31245抗生素★+活性肽★B41245抗生素★+活性肽☆B51248抗生素☆+活性肽★B61247活性肽☆B71244活性肽★治疗效果评价•通过CMT试剂检测，通过治疗前后数值结果变化判断乳房炎治愈率。•检测药物残留，鉴定生物安全性•测定产奶量变化，评价其经济性四、结果与分析•1.免疫活性因子制备和检测结果、生物安全性•2.临床疗效、药物残留、产奶量变化制备产品的的照片1.免疫因子的制备和检测•物理性状得到比重为1.021的淡黄色，有特殊腥味的透明液体。•理化性质PH为7.0，符合制剂要求；经紫外光谱分析，该制剂在250nm-260nm处有吸收高峰，A260nm/A280nm=2.28；用二羟基甲苯法测得核糖含量为33ug/ml；用双缩尿法测的多肽含量为315ug/ml；无菌检验、蛋白质检验、抗原检验及过敏实验结果均为阴性。毒性检验结果表3毒性检验结果•从表结果可以看出，制得的免疫活性因子分别在原液；浓缩2倍、5倍、10倍；稀释2倍、5倍、10倍的情况下，给小鼠腹腔注射，均无毒性反应。结论：用3.1.2.1方法制得的免疫活性因子对小鼠无毒性反应。1234567浓度原液浓缩10倍原液浓缩5倍原液浓缩2倍原液浓度原液稀释5倍原液浓缩10倍生理盐水对照注射方式腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射注射剂量0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g0.5ml/10g毒性反应————-———热源检查结果表4热源检查结果•结论：制得的免疫活性因子不含热源物质。组别注射前15min注射后1h注射后2h注射后3139.8±0.239.8±0.339.7±0.139.6±0.3238.9±0.339.3±0.337.8±0.238.4±0.2339.7±0.139.5±0.239.6±0.239.7±0.3439.8±0.239.9±0.239.6±0.139.8±0.3免疫活性因子对小鼠血液白细胞数量的影响表5免疫活性因子对小鼠血液白细胞数量的影响•分析：一次给予机体较大量的免疫活性因子，可以迅速提高机体内免疫细胞的数目，但是长时间使用，不会使血液内淋巴细胞的数量无限制的增高。上实验表明结果表明，给与小鼠复方免疫因子以后，血液中的免疫细胞会出现含量增多的现象，但升至230左右，会出现停顿现象，在5天内未见其继续升高。分组1d2d3d4d5d6dA123±1.2142±0.9185±2.1201±3.0217±2.1225±2.4B125±1.3165±2.0193±2.2203±2.5215±1.1231±2.3C124±2.1170±1.1195±1.2215±1.3237±2.0234±3.1D126±1.2165±1.4163±1.3153±1.2165±1.2158±2.2免疫活性因子对小鼠外周血吞噬性白细胞吞噬功能及免疫器官重量的影响表6免疫活性因子对小鼠外周血吞噬性白细胞吞噬功能及免疫器官重量的影响•分析：连续以不同剂量复方免疫活性因子刺激小鼠5天后，小鼠外周血白细胞吞噬率明显提高，但机体免疫器官重量无明显变化。分组吞噬率(%)免疫器官(mg)/体重(g)脾脏重量胸腺重量A65.87.92±0.232.35±0.32B57.27.37±0.342.55±0.26C63.57.65±0.132.55±0.37D43.77.82±0.282.32±0.422.免疫活性因子对奶牛乳房炎的临床治疗试验组别数量患病乳区数治疗有效头数痊愈乳区数有效乳区数治愈率（%）有效率（%）A11248882416.766.7A2124710102221.367.6A3124512252255.697.8A4124512221848.995.6A512471240785.1100A6124712172836.295.7A7124612281660.894.6•疗效试验表7****奶牛厂治疗结果表8********奶牛场治疗效果•表7，8显示，抗生素乳房灌注+复方免疫活性因子肌肉注射组治愈率明显高于其他各组，有效率达到97.8%以上，也明显高于其他治疗组。组别数量患病乳区数治疗有效头数痊愈乳区数有效乳区数治愈率（%）有效率（%）B112481082018.865.3B2124710122225.572.3B3124512281662.297.7B4124812232051.195.5B5124812381979.297.8B612481223224993.7B7124812271756.389.5•药物残留表9**牛场愈后牛乳中抗生素残留统计组别第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天A1++++++++±±-A2++++++±---A3+++++++++±-A4+++++++++--A5++++++±---A6-------A7-------表10********奶牛场愈后牛乳中抗生素残留统计•表9、10显示，使用乳房灌注给药的方式用抗生素治疗奶牛乳房炎，第三天时抗生素残留几乎不可见，而使用抗生素肌肉注射地方法给药，乳汁中的抗生素残留在乳房炎治愈后的第四天才能消失，复方免疫活性因子和抗生素的联合应用，对抗生素的代谢没有明显的影响。组别第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天B1++++++±±--B2++++±----B3++++++±--B4++++++±--B5+++++±----B6-------B7-------•产奶量统计•表11******牛场治疗过程中及愈后奶牛日平均产奶量统计组别第1天第2天第4天第6天第8天A121.43±3.5221.45±4.3621.55±4.3321.88±2.8521.93±6.03A220.53±3.3220.32±4.3421.30±4.3321.48±2.3521.58±2.03A322.72±3.4522.86±3.4323.78±3.4823.20±3.8323.38±2.33A420.31±3.3821.33±3.0921.75±7.3821.75±7.3821.83±4.38A521.62±7.8223.30±7.8723.54±1.3023.02±3.6323.98±3.02A620.33±3.5721.33±3.2921.75±7.0821.75±7.6821.73±4.58A720.70±3.5420.86±3.6221.78±3.4822.02±3.0622.38±3.32表12**奶牛场奶牛治疗过程中及愈后日平均产奶量统计•表11、12表明，在使用抗生素和复方免疫活性因子治疗奶牛乳房炎的过程中，患病奶牛的产乳量军有一定的回升，但使用复方免疫活性因子治疗的奶牛产奶量回升明显，这可能与复方免疫活性因子能够参与受损奶牛乳腺细胞有关。组别第1天第2天第4天第6天第8天B123.97±3.3224.12±6.0324.32±3.6524.50±3.4524.89±6.83B224.73±3.6924.32±3.5624.62±7.5624.88±3.5724.84±2.74B326.22±3.4226.65±3.8927.59±4.5127.38±6.6527.33±2.58B423.67±3.3825.49±3.7824.76±4.1825.26±5.3625.12±3.63B524.53±7.7227.47±7.0827.69±3.3227.80±7.3827.34±3.47B623.17±2.2425.06±7.8425.18±4.7225.09±2.6625.37±2.37B723.89±3.6525.43±1.9425.98±1.3526.57±2.7326.56±3.48五、讨论•1.试验结果显示使用免疫因子和抗生素联合治疗方法进行治疗效果良好，治愈率最高达到85.1%，有效率最高达到100%，疗效好于单独使用免疫活性因子或单独使用抗生素，单独使用免疫活性因子的疗效优于单独使用抗生素组。其中对免疫因子进行肌肉注射，抗生素进行乳房灌注联合治疗组疗效最佳。其中治疗效果为免疫因子进行肌肉注射，抗生素进行乳房灌注联合治疗组优于免疫活性因子和抗生素均肌肉注射组，免疫活性因子和抗生素均肌肉注射组优于单独免疫因子肌肉注射组，单独免疫因子肌肉注射组优于免疫活性因子和抗生素