26蛋白质相互作用研究方法

Protein-proteinInteraction蛋白质-蛋白质相互作用研究方法许多生命活动是以蛋白质分子的结合和解离来实现的，细胞的各种重要生理活动，细胞对外界环境及内环境作用的反应等，均是以蛋白质间相互作用为纽带，形成信号转导网络系统。稳定相互作用形成蛋白质复合体（proteincomplex）瞬时相互作用（enzyme-substrate）生物学效应稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋白质相互作用的内涵。蛋白质相互作用关系的复杂性，超出任何个人或特定机构的研究能力。如何研究蛋白质相互作用？酵母蛋白质相互作用联络图人蛋白质相互作用联络图如此复杂的相互作用，哪些是有相关功能的？哪些是“噪音”？蛋白质-蛋白质相互作用研究方法•酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)•串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification,TAP)•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)•双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)•荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)酵母双杂交系统(Y2H)很多真核生物的转录因子如酵母Gal4由两个具有不同功能的结构域组成：转录激活结构域(Transcriptionalactivationdomain,AD)和DNA结合结构域(DNAbindingdomain,BD)。BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，AD可和转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。lacZUASADBDlacZ两种待检测蛋白(X、Y)分别和AD、BD融合表达,X与Y之间的相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列（upstreamactivationsequence）结合，进而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。lacZUASBDlacZ优点：简便、易用、费用低廉，能检测到瞬时或较弱的蛋白质相互作用；缺点：较高的假阳性，不能真实反映蛋白质在自身细胞中的相互作用，表达的融合蛋白最终要运送到酵母细胞核，而有些蛋白可能具有其他亚细胞定位信号肽等。蛋白质-蛋白质相互作用研究方法•酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)•串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification,TAP)•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)•双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)•荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)串联亲和纯化(TAP)基因构建：在目标蛋白的一端依次导入钙调蛋白结合肽、TEV蛋白酶切位点和蛋白标签(如蛋白A、寡聚组氨酸肽段等)，进而在宿主细胞中进行融合表达，在生理条件下形成与目标蛋白相互作用的蛋白复合物。串联亲和纯化分离纯化：第一步利用与蛋白标签具有亲和作用的色谱柱结合标签；第二步洗脱后采用TEV蛋白酶断裂TEV蛋白酶切位点；第三步利用与钙调蛋白结合肽具有亲和作用的钙调蛋白色谱柱结合钙调蛋白标签；第四步洗脱蛋白，进一步进行鉴定。串联亲和纯化优点：能减少非特异性蛋白结合，能保留蛋白复合物在细胞内的修饰和结合状态。缺点：需要较多的样本材料来提取蛋白，价格比较昂贵,不能高效检测到瞬时或较弱的蛋白质相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用研究方法•酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)•串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification,TAP)•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)•双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)•荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白的复合物，这样就可以先用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来，然后用另一种蛋白的抗体进行Westernblotting检测。免疫共沉淀免疫共沉淀优点：可以保留蛋白质的修饰和结合状态，同时所需的样本量较少,实验成本较低，减少了纯化步骤，能检测到瞬时和较弱的蛋白相互作用；缺点：Co-IP特异性较低，洗脱混合物中往往含有较多的非特异结合蛋白。因此，Co-IP检测到的潜在相互作用蛋白需要通过BiFC、FRET等其他方法进一步验证。蛋白质-蛋白质相互作用研究方法•酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)•串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification,TAP)•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)•双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)•荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)原理是将荧光蛋白分成两个无独立功能的片段，分别与需要检测的蛋白X和蛋白Y融合表达，如果bait融合蛋白和prey融合蛋白存在相互结合作用，而这种结合促使荧光蛋白的两个片段相互作用发出荧光。双分子荧光互补技术优势：能简单方便地通过观察荧光鉴定蛋白质相互作用，不依赖外源的荧光素或显色剂等，能检测到瞬时或者较弱的相互作用，并且可提供亚细胞定位信息。缺陷：融合蛋白的相互结合和荧光发生有一定时间延迟，一些融合蛋白的结合是不可逆的，不能实时反应蛋白质的结合和分离情况。蛋白质-蛋白质相互作用研究方法•酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)•串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification,TAP)•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)•双分子荧光互补(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)•荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)基本原理：分别将bait蛋白、prey蛋白与相应的供体荧光基团(如ECFP)和受体荧光基团(如EYFP)融合,当bait蛋白和prey蛋白相互结合作用时,供体基团和受体基团两者之间的距离很近(约10nm),供体基团的发射光激发受体基团发射荧光。常用的供体荧光蛋白和受体荧光蛋白对有BFP-GFP、BFP-EGFP、CFP-YFP等。荧光共振能量转移(FRET)优点：能比较可靠地反映蛋白质相互作用时的距离；能检测到瞬时、较弱的蛋白质相互作用；能同时检测到两蛋白的细胞分布和作用位点。缺点：是供体蛋白的激发光谱和受体蛋白的光谱可能存在重叠,影响实验结果；供体蛋白和受体蛋白的空间结构较大,限制了两者之间的距离，导致FRET发生效率低(约40%)，且易出现假阴性。谢谢