65琼脂糖凝胶电泳

DNA琼脂糖凝胶电泳指导教师：龚熹生物基础实验中心实验目的：学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作。实验原理：1.琼脂糖凝胶电泳是最常用的鉴定DNA的方法，它简便易行，只需少量DNA。2.琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。3.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。DNA分子的迁移速率与其相对分子质量的对数成反比。4.观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用荧光染料溴乙锭（EB）染色，EB在紫外灯照射下，发红色荧光。实验器材：移液器水平电泳槽一次性手套微波炉紫外检测仪水平仪tip量筒锥形瓶实验器材：实验试剂：1.pH8.0TAE缓冲液2.凝胶上样缓冲液：0.2%溴酚蓝，50%蔗糖3.琼脂糖4.1mg/mlEB溶液5.Marker6.PCR扩增特异DNA片段操作：1.琼脂糖凝胶的制备称取0.45g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mlTAE缓冲液，保鲜膜封口，置微波炉加热至完全澄清透明取出摇匀，琼脂糖的浓度为1.5%。待琼脂糖凝胶溶液冷却至50℃，再加入1.5ml溴乙锭，使其终浓度为0.5微克/毫升。2.凝胶板的制备用制胶器将紫外透光凝胶盘固定好，采用水平仪调整平衡使凝胶盘位于同一水平面。将适宜的梳子垂直架在凝胶盘内槽的一端，使梳齿距玻璃板之间尚有0.5-1mm的距离。将冷到50℃左右的琼脂糖凝胶，缓缓倒入凝胶盘内槽，厚度适宜（注意不要有气泡）。3.点样待凝胶凝固后，小心取出梳齿，将凝胶盘放入电泳槽內。加入足够的TAE电泳缓冲液，使液面略高出凝胶面。取5微升PCR扩增产物，向其中加入1微升的上样缓冲液，混匀后用移液器将其加入加样孔，记录样品点样次序与点样量。4.电泳接通电泳槽与电泳仪的电源，调节电压90V,当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。5.观察在紫外灯下观察凝胶，有DNA处应显出橘红色荧光条带。记录电泳结果。注意事项：1.倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使凝胶盘变形。2.胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔。3.点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。4.EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔，紫外线照射不宜太久。作业：画出电泳图，分析观察到的结果。