柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿

柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿Cu/Zn-SOD基因的克隆及生物信息学分析答辩人：于超然指导教师：许月英林晓飞内蒙古大学本科毕业论文答辩研究背景柠条锦鸡儿(Caraganamicrophylla)和小叶锦鸡儿(Caraganakorshinskii)分布于在我国内蒙古西部、陕西北部及宁夏；在蒙古国也有分布。作为半荒漠区的旱生植物，目前人们已经从植物的形态结构、生理生化与保护酶系统对其进行了研究。但对干旱胁迫下保护酶基因的克隆的研究还是空白。研究背景本实验以柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿两种植物为实验材料，采用PEG-6000溶液模拟干旱胁迫环境，利用PCR技术对两种植物的SOD基因进行克隆，并进行相关生物学分析。本实验有助于了解锦鸡儿属植物强抗逆性的分子机制，便于进一步开发和利用锦鸡儿植物资源，也为进一步分析酶基因的表达与逆境因子的相互关系以及充分证明和解析SOD基因在植物抗逆中的作用及其机制提供基础和手段；同时为利用转基因技术选育抗逆新品种奠定基础，对于挖掘植物抗旱基因资源，提高植物的抗旱能力提供一条有效途径。材料方法1.植物材料：柠条锦鸡儿种子（巴彦淖尔狼山前冲积扇柠条锦鸡儿灌丛）小叶锦鸡儿（锡林格勒锡林河流域小叶锦鸡儿灌丛）2.主要方法：RT-PCR,PCR技术。三技术路线PCR扩增CTAB法提取RNAPCR产物回收与TA克隆的连接转化、序列测定RT-PCR引物设计系统树构建引物设计根据郝婧克隆得到的柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿SOD基因中间片段，使用Primer5设计两种植物SOD基因5’端下游引物SOD5-R和3’端上游引物SOD3-F2。又根据鬼箭锦鸡儿序列选择了一段最为3’端上游引物SOD3-F1。引物序列：(1)5RACE:UPM:5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX–3'(X=undisclosedbaseintheproprietarySMARTeroligosequence)SOD5-R:5’-CCCTAGATCACCAGCATGGCGACT-3’(2)3RACE:SOD3-F1:5’-AGTTCTTGGCAGCAATGAGG-3SOD3-F2:5’-GGACACCACAAATGGCTGCAT-3’M13M4:5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’(3)Actin引物：CKACT-F:5’-TCTTGACCGAGCGTGGATA-3’CKACT-R:5’-TTGGAAGGTGCTGAGGGAT-3’引物设计3’RACE5’RACE实验结果SOD基因序列分析比对将所获得的序列进行拼接组合，使用Blastx()对两种植物的基因序列进行比对分析，结果显示所得到的基因序列与其它生物的Cu/Zn-SOD基因具有高度的同源性，说明所得到的基因序列是Cu/Zn-SOD基因。使用在线分析软件ClustalW与不同植物的Cu/Zn-SOD氨基酸序列进行相似性分析。选取鬼箭锦鸡儿、豌豆（Vignaradiata(L.)Wilczek）、豇豆（PisumsativumL）、郁金（CurcumaaromaticaSalisb）、小麦（TriticumaestivumL）、山羊都属（Galegaorientalis）、紫苜蓿（Medicagosativaputative）、肝片吸虫（Fasciolahepatica）、人（Human）、小鼠（Rat）等进行基因的系统发育关系分析柠条锦鸡儿SOD基因序列为750bp，编码区为459bp，编码152个氨基酸小叶锦鸡儿为774bp,编码区为459bp，编码152个氨基酸柠条与小叶相似性为100％，二者与鬼箭锦鸡儿相似性为92％，与豇豆相似性为88％，与绿豆相似性为88％，与郁金相似性为81％。Cm：柠条锦鸡儿;Ck:小叶锦鸡儿;Cj：鬼箭锦鸡儿;Vr：豇豆；Ps：豌豆；Ca:郁金；Ta：小麦；Ms：紫苜蓿。讨论•根据Cu/Zn-SOD中间片段，设计特异性引物，克隆得到柠条锦鸡儿和小叶锦鸡儿Cu/Zn-SOD基因片段序列。经比对确认，表明实验所获得的序列为Cu/Zn-SOD全长。通过氨基酸序列比对，发现克隆得到SOD基因与鬼箭锦鸡儿、豇豆、豌豆的相似性依次为92％、88％和88％，具有高度的保守性，因此不同植物超氧化物歧化酶基因的差异主要应该表现在内含子上，这可能是导致不同植物对环境信号和逆境的差异性反应的因素之一。•目前先关研究已经表明植物体内抗氧化酶系统SOD,POD,CAT和ASP活性的提高能增强植物对多种胁迫的抗性。通过对转SOD基因植物的抗逆性研究表明SOD在转基因支植株中的过量表达能不同程度的提高植物对环境胁迫的抵抗能力。但单一的转SOD基因不能显著提高植物的抗逆能力。因此，对于植物体内抗氧化酶系统还需进一步研究，探寻那种酶与SOD共同提高表达能够显著提高植物抗性。