7临床检测--谷丙转氨酶活性的测定(影像中医)

血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（改良赖氏法）生化实验1.掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本原理。2.熟悉血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的具体操作方法。3.了解血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的临床意义。【目的要求】临床意义谷丙转氨酶(GlutamicpyruvicTransaminase，GPT)丙氨酸氨基转移酶(AlanineTransaminase，ALT)ALT(GPT)广泛存在于机体各种组织中，但在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是急性肝炎及肝细胞坏死，血清中谷丙转氨酶活性显著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此酶活性也可中度或轻度增高。正常人各组织GOT及GPT活性(单位/克湿组织)组织GPTGOT肝44,000142,000肾19,00091,000心7,100156,000骨骼肌4,80099,000胰腺2,00028,000脾1,20014,000肺70010,000血清1620转氨酶是反映肝实质性损害的重要指标。谷丙转氨酶（GPT）主要位于肝细胞浆内。谷草转氨酶（GOT）则除胞浆外，也见于线粒体内。位于胞浆内的GPT较易逸出，故一般肝损害时，GPT的升高大于GOT的升高；但在酒精性肝炎时，由于线粒体明显损伤，GOT的升高明显大于GPT的升高。但GOT的特异性不如GPT。GOT/GPT比值可作为肝损害严重程度的指标，轻度损害时比值小，严重损害时比值大。比值为1.2～2.26时，常为暴发性肝炎。如何测定酶的活性?酶活性单位定义中必须规定哪些条件?血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，然后测定丙酮酸的生成量，即可计算酶活性的大小。【实验原理】生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，产生丙酮酸2,4-二硝基苯腙，后者在碱性环境中呈现红棕色。颜色之深浅与丙酮酸含量成正比，与标准丙酮酸的显色进行比较，即可测定丙酮酸的含量。α酮戊二酸丙氨酸天冬氨酸α酮戊二酸β脱羧酶谷草转氨酶不同的酶活测定方法一般临床上用以测定GPT及GOT活性的方法有改良的穆氏法、金氏法及赖氏法，这些方法都是基于上述原理而设计的，操作也基本相同，只是这些实验的某些条件、活性单位的规定和计算有所差异。改良的穆氏法（Mohun）规定血清在37℃（pH7.4）的条件下，与底物作用30分钟后，每生成2.5μg丙酮酸为一个转氨酶活性单位。金氏法（King）则规定在同上条件下，与底物作用60分钟后，每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。在紫外分光光度计中，1ml血清(反应溶液总量为3ml)在340nm波长下，用内径为1.0cm的比色皿，在25℃，1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH+H+变成NAD+，使光密度下降0.001为1个转氨酶活性单位。卡门氏单位的定义为：丙氨酸+α-酮戊二酸谷氨酸+丙酮酸GPT乳酸脱氢酶NAD++乳酸NADH+H+•NADH在260nm和340nm处各有一吸收峰，而NAD+只有260nm一处吸收峰，因此以NADH为辅酶的各种脱氢酶都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶活力。丙氨酸+α-酮戊二酸谷氨酸+丙酮酸GPT乳酸脱氢酶NAD++乳酸NADH+H+改良赖氏法显色反应分光光度法•赖氏法（Reitman）本身并未对转氨酶活性单位提出规定，他是用卡门氏法（Karman）来定单位的。即用卡门氏法所测出的单位数相当于赖氏法所产生的丙酮酸量的相关系数，套用卡门氏单位而来。•由此可见，测定同一份血清的转氨酶活性，用不同方法测算，其值不一样。因而它们的正常值范围也可有显著差异。赖氏法卡门氏法试剂ALT底物液：α酮戊二酸，丙氨酸pH7.4磷酸缓冲液丙酮酸标准液：2μmol/ml2,4-二硝基苯肼溶液0.4mol/LNaOH012345丙酮酸标准液(ml)0.000.050.100.150.200.25ALT底物试剂(ml)0.500.450.400.350.300.250.1M磷酸盐缓冲液pH7.4(ml)0.100.100.100.100.100.10相当于GPT活性(卡门氏单位)0.00285797150200实验操作1.标准曲线的制作:37℃，5min各管加2,4-二硝基苯肼0.5ml，混匀37℃，20min各管加0.4mol/LNaOH溶液5ml，混匀室温，10min以蒸馏水调零点，用520nm波长比色，读取各管光密度各管读数减去对照管(O管)的光密度，然后以光密度值为纵坐标，各管相应的转氨酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。实验操作1.标准曲线的制作:（续）TC血清(ml)0.1—ALT底物液(ml)0.50.5混匀后，置37℃水浴中保温30分钟2，4-二硝基苯肼液(ml)0.50.5混匀后，置37℃水浴中保温20分钟血清(ml)—0.10.4mol/LNaOH(ml)5.05.02.酶活性测定：测定前将底物缓冲液在37℃水浴中预温5分钟，再按下表操作。混匀，室温中放置10分钟，以蒸馏水调零点，用520nm波长比色，读取光密度。用T-C管的光密度查标准曲线，即得到待测血清中所含ALT的酶活性。参考值：5~25卡门氏单位实验结果012345A520nmAn-A0卡门氏单位02857971502001.标准曲线2.血清ALT活性TCA520nmAT-ACALT活性注：酶活性在97卡门氏单位以下，标本经稀释后与光密度值的线性关系良好，酶作用时间较短，更符合酶测定要求。注意事项1、不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批本只做2-3个血清对照管求其平均值即可。2、严重脂血症或黄疸、溶血的血清都能引起测定管OD值的增加，因此，检测此类标本时，应作血清对照管。3、赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好，超过此活力的标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。4、加入2,4-二硝基苯肼溶液后需充分振荡混匀，否则会影响重复性。5、ALT底物液与2,4-二硝基苯肼液配制要准确。6、除了丙酮酸与2,4-二硝基苯肼在碱性溶液中能成腙外，α-酮戊二酸亦能与2,4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm处有较大差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。7、DL型丙氨酸，如改用L型丙氨酸，可减半量（因转氨酶只作用于L型丙氨酸）。