薄层层析法

第八章色谱分离技术第四节薄层层析法刘耀玺薄层色谱法（Thin-Layerchromatography.简写TLC）是一种简便、快速、微量的层析方法。一般是将某种吸附剂或支持剂均匀地铺在玻璃板上，形成一个薄层而进行层析的一种方法。广泛地用于化学成分的分离、精制、定性鉴定和含量测定。其原理与柱层析按其分离原理可分为吸附薄层层析和分配薄层层析两种。一、吸附薄层层析吸附薄层层析就是利用混合物中各成分对同一吸附剂吸附能力的不同，而使各成分达到分离目的层析法。凡柱层所用的吸附剂，均可用在薄层层析上，主要区别是柱层析所用的吸附剂粒度较大，一般为100-160目，而薄层层析用吸附剂的粒度较细，一般为160-2501、吸附剂薄层层析最常用的吸附剂有氧化铝和硅胶等。由于吸附剂的吸附能力有强有弱，吸附力弱的对化合物的吸附就不甚牢固。这就是吸附层析能分离不同物质的基本原理之一。吸附力强弱与吸附剂本身的性质和被吸附的化合物的性质有关。吸附剂：吸附剂的选择常是分离工作成败的关键。对吸附剂的选择与要求和吸附柱层析相同。要求小于250目，并要求粒度均匀。用于薄层层析的吸附剂或予制薄层一般活度不宜过高，以Ⅰ-Ⅲ级为宜，而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细展开距离相应缩短。一般不超过10cm。否则可2、展开剂当吸附剂活性为一定值时（Ⅱ级或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。例如使用亲水性的吸附剂（如氧化铝和硅胶）时，若被分离成分极性较大，应选择吸附性较弱（活性较低）的吸附剂和极性较大的展开剂；若被分离的成分极性较小，亲脂性增强时，则应用吸附性强（活性高）的吸附剂和极性小的展开剂。薄层层析常用的展开剂按极性大小(由小到大)排列如下:戊烷石油醚四氯化碳苯乙醚氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇有时为了调整展开剂的极性可使用不同比例的混合展开剂，如氯仿—无水乙醇19∶1或1∶1等。对各种展开剂要求纯度高不含或少含杂质，必要时可重新蒸馏或经过特殊处理，方可应用。3、被分离的成分被分离的成分与吸附剂、展开剂共为层析中不可缺少的三个方面，彼此紧密相关。在指定的吸附剂和展开剂的条件下，各成分的分离情况直接与被分离成分的结构和性质有关。如对氧化铝和硅胶一类吸附剂，被分离的成分极性大，被吸附的作用也强。看一个化合物的极性大小，不但要看特殊的功能基团，还要看化合物的整个分子极性大小，如整个分子极性基团越多，被吸附的性能就会更大，分子中双键多，吸附力强，共轭双键多，吸附力增大；在同系物中碳原子少的比碳原子多的吸附力强；在同一母核中，羟基处于能形成分子内氢键位置时，其吸附力弱于羟基不能形成氢键的化合物。总之，全面考虑吸附剂、展开剂和成分三者间的相互关系，是分离效果成败的关键。二、分配薄层层析分配层析是利用混合物中各成分在固定相和流动相间不断地分配。由于各成分在两相间分配系数不同而达到分离的一种层析方法。分配层析的原理与吸附层析不同，它不是经过吸附解吸附、再吸附而解吸附的过程，而是通过在薄层上两相溶剂反复萃取，利用分配系数不同而达到分离目的。分配薄层层析就是将一种叫做支持剂(或称载体)的固体粉末，铺在玻璃板上成为一均匀的薄层，支持剂上吸附着一种极性溶剂，作为固定相，另用一种与固定相不相混溶的极性较小的溶剂展开，这种溶剂称为流动相。由于各成分在两相间分配系数的不同，在固定相中溶解度大的成分移动慢，而在流动相中溶解度大的成分移动快，这样不断的移动过程中，使得各成分分离。分配薄层层析主要因素也有以下三点:1、支持剂:常用的支持剂有硅胶、微晶纤维素、硅藻土等。硅胶、硅藻土和徽晶纤维素等，吸附大量水分后，失去2、展开剂:分配层析所用的展开剂，多为两种以上的溶剂，按一定比例组成的溶剂系统。固定相是极性大的溶剂（如水、酸、碱）、不同pH缓冲液和非水而亲水性的溶剂如甲酰胺、三甲基甲酰胺、丙二醇、甘油、乙二醇等；流动相则为与水等不相混溶的极性小的溶剂，如石油醚、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、醇类等。选择展开剂的原则是:若被分离的成分亲水性较强时，则展开剂的极性也应较强。反之，成分亲脂性强，而展开剂的亲脂性亦应较强。3、被分离的成分:虽然各种生物化学成分都可采用分配层析分离，但更适用于亲水性强而又略溶于亲脂性溶剂中的成分分离，如某些苷类、酚类。三、薄层层析操作技术包括吸附剂的选择与处理、薄层板的制备、点样、展开、显色、测Rf值及定量等操作程序。1用于柱层析的吸附剂,如氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺、纤维素、淀粉、蔗糖等，一般均可用于薄层层析。其中以氧化铝和硅胶最为常用。氧化铝的规格有酸性、中性和碱性三种，可根据需要进行选择。而硅胶是带微酸性吸附剂，适用于酸性和中性物质的分离。近年来采用聚酰胺成功地分离了黄酮类、酚类和鞣质，也有总之，进行分离实验时，首先采用氧化铝或硅胶，不适用时，再考虑选择其他种类吸附剂。①氧化铝:一般市售的氧化铝，若大小颗粒范围较大，则不能制成均匀的薄层，而且展开剂前缘不齐，不能获得良好的分离效果，须经重新过筛，一般以150—200目为宜。太粗分离效果不好，太细展开速度太慢。层析用氧化铝分酸、碱、中性三种规格，要按分离的成分性质去选择哪种规格的氧化铝。如选择不当对分②硅胶:市售层析用硅胶G一般不必再进行处理；如果是柱层析用的硅胶或工业用硅胶，必须经过处理才能应用。取市售的层析用硅胶，首先过180目筛，通过者可供层析用，未通过者可用磨粉机磨细，筛取180—200目间的细粉；如为工业用硅胶，需加入2N盐酸浸泡24小时以上，不时振摇，使灰色粉未渐变为白色，盐酸液呈浅黄色，抽滤，如盐酸液黄色较深时，需酸洗2—3次，最后用蒸馏水洗至pH为6左右，检查无氯离子再于120℃烘12—24小时，干③纤维素和聚酰胺等有机性粉未，要求略大些，可在80—140目间，过粗者要粉碎。2、层析板的制备①含粘合剂的层析板:在吸附剂中加入适量的粘合剂，调成糊状，然后用特制的铺层器铺板。或用手工方法铺制。介绍如下:将调成糊状的吸附剂混悬液倒在清洁玻璃板上，轻轻晃动，使其分布于整块板上，放平晾干后，加热活化。用这种方法制得的板，称为硬板。常用的粘合剂有烧石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠(简写为CMC—Na)和琼脂等。烧石膏用量为吸附剂的10—15%；淀粉为5%；CMC为0.5—1%。以淀粉为粘合剂的板显色剂不能含碘化钾等，否则，会使板面变兰或变黑，斑点不清晰。②不含粘合剂的层析板:一般称为软板。又可分干法制板与湿法制板两种:(1)干法制法:取玻棒或细玻璃管，两端用金属片或胶布、橡皮圈包上(厚度0.3—1毫米)，中间距离根据需要确定。取玻璃板(单向层析一般为5×20cm)上面撒上吸附剂，用玻璃棒向前推动，务使吸附剂铺展均匀，并形成一薄层，铺好后即可使用。如欲双向层析，需取20×20cm玻璃板铺制。如这种方法制得的薄层板，质地疏松，很不坚固。稍受振动或风吹就会把薄层损坏，因此在以后各操作过程中，都要注意加倍小心。这种铺制常用的吸附剂有氧化铝和硅胶。(2)湿法制板:有的吸附剂用干法制板，很难铺匀。这时氧化铝糊板:取层析用氧化铝，加适量水调聚酰胺板:聚酰胺粉干法制板较困难。一般要加适当有机溶剂或石膏、纤维素等。例如取聚酰胺粉5g，加氯仿2份、甲醇3份的混合溶剂45ml，混匀调成糊状铺制。微晶纤维素板:取纤维素1分加5-6倍的水研磨或加入丙酮，调成糊状，铺制。上述各种方法制得的薄层板，若用于分配层析时，则铺层后，置于室温下放置充分干燥，即可使用。若作吸附层析时，自然干燥后则需要活化。活化的条件视吸附剂和要求不同而异，如氧化铝G薄层置200—220℃烘4小时，可得活性Ⅱ级的薄层；150～160℃烘4小时，可得Ⅲ—Ⅳ级活性薄层。硅胶G有在110℃烘1小时、80℃烘半小时或临用前105℃活化半小时等，根据需要而定。活化后的薄层必须置干燥器中保存备用。如果展开剂中含有水时，作分配层析板不必活化，常温下干燥即可应用。3、薄层层析操作①点样:将样品用合适的溶剂溶解(尽量避免用水，因斑点容易扩散，而且影响吸附剂的活性)。一般多用氯仿、丙酮、乙醇。最好采用与展开剂极性相近的溶剂或低沸点溶剂，以免影响分离效果；溶液浓度不宜过浓或过稀。然后用内径约为1毫米、管口平整的毛细管吸取样品液，轻轻点在距薄板下端2.5厘米处，每次加样后，原点扩散直径不超过2—3毫米，如果一次加样品②展开:点样完毕后，接着就是展开操作。(1)展开剂的选择：展开剂的选择原则同柱层析和纸层析一样。主要根据样品的极性及样品溶解度，以及样品在溶剂中的分配系数来选择。也可以参考前人的经验。常用的溶剂极性顺序是:石油醚二硫化碳四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯正丁醇丙酮丙醇乙醇甲醇在一般情况，先选用单一的溶剂如乙酸乙酯进行展开，如发现此成分Rf值很大时，可考虑换用一种极性较小的溶剂，或者在原来的展开剂中加入适量的极性较小的溶剂去展开，反之亦然。(2)展开操作展开操作是在密闭的容器中进行的，根据薄层板的大小，选择不同的层析缸。配好展开剂，将展开剂（一般2-10mL）倒入层析缸，密闭放置一定时间，待层析缸被展开剂饱和后（目的是防止边缘效应的产生），再迅速将薄层板放入（注意：切勿使溶剂浸没样品点，展开剂浸入薄层高度约0.5mm即可），密闭，展开即开始。当溶剂移动到接近薄板上端边缘时，取出薄板，画出溶剂前沿。展开方式可以分为：A、上行展开法和下行展开法B、单次展开法和多次展开法C、单向展开法和双向展开法③显色：一般纸层析用的显色剂，均可用在薄层层通常在展开结束后，首先可用紫外线分析灯观察有无萤光斑点，用小细针在薄层上划出斑点位置，再选择显色剂显色，软板与硬板显色方法不同，现分述如下:(1)软板的四种显色法：软板因不含粘合剂，直接喷洒显色剂，可将吸附剂吹散，造成整个试验失败。故采用下述方法:1)喷雾法:每类化合物都有特定的显色剂。展开完毕，进行喷雾显色，多数在日光下可找到色点。注意：氧化铝软板在展开后，取出立即划出前沿，趁湿喷雾显色，如果干后显色，吸附剂会被吹散。2)碘蒸汽法3)压板法4)侧吮法5）生物印迹法：抗生素等生物活性物质可以用生物印迹法进行。取一张滤纸，用适当的缓冲溶液浸湿，覆盖在板层上，上面用另一块玻璃压住。10-15分钟后取出滤纸，然后立即覆盖在接有实验菌种的琼脂平板上，在适当温度下，经过一定时间培养后，即可显出抑菌圈。6）紫外线照射法：常用254nm和365nm波长的紫外线。(2)硬板的显色:可将显色剂直接喷洒在薄层上,进行显色，有立即显色的。也有加热一定温度后才显色的。如喷10%硫酸，加热100℃后才能显色。薄层层析的Rf值的精确度仅达±0.05。如果要想获得两次完全重现的Rf值，则必须使两次测定条件完全一致。所以通常作样品成分鉴定时，都采用已知成分对照展开，最理想的Rf值为0.4—0.5。良好的分离在0.15—0.75。若小于0.15或大于0.75者，则分离不好。其影响因素主要有以下几点:1温度。23展开时间和展开距离:4层析缸内展开剂蒸汽的饱和程度:5吸附剂的酸碱性:6展开剂的组成:7展开剂的pH8样品的性质及浓度:9活化程度(加热时间和温度)以及溶剂的纯度、展开方式、层析缸的大小形状等等皆能影响Rf值，致使薄层层析的Rf值重现性较差。因此不能仅用Rf值来鉴定未知成分，必须用已知样品作对照。五、应用1无机及有机化合物的鉴别:2含量测定:3微量分离:4快速有效的选择柱层析用的展开剂及鉴定柱5在薄层板上进行斑点微量化学反应，如氧化还原及衍生物的制备等，进一步鉴定物质的成6为植物分类学中化学成分的快速鉴定提供了方法。7化合物分子功能基的研究:利用功能基与吸附力的不同已研究了甾体骨架上功能基的位置与构型之间的关系,并研究了各种8化合物分子空间异构体的分离:如纸层析对分离对位和邻位的香兰素极易分离。9放射性化合物的测定分离:应用一种连续自动装置,可以从薄层板上直接测定放射10配合微生物测定法进行抗菌素的鉴定。作业:1、薄层色谱法常用的显迹方法有哪些？试述其适用范围。2、薄层色谱法的操作要点有哪些？