中国基因工程药物研究进展

TrendsInBIo/PharmaceuTIcalIndusTry|2-20089ChinaBiopharmaProgress尚珂胡鹤胡又佳中国基因工程药物研究进展有关作者：尚珂博士，女，1980年生，现就职于上海医药工业研究院，创新药物与制药工艺国家重点实验室（筹），任助理研究员。2001年毕业于中国药科大学，2006年获上海医工院微生物与生化药学博士学位。主要研究方向：链霉菌基因工程；重大抗生素品种产生菌的基因工程改造。我国生物技术药物工业总产值至2006年为400~500亿元，仍然保持了高速的增长，新批准的进行临床研究和注册的基因工程药物及新剂型有17个，但其中大部分属于新剂型。创新药物的研究更多地体现在科研领域，尤其是在基因重组蛋白方面，无论是研究的创新性还是品种的多样性都体现了我国在基因工程药物研究领域所取得的长足进步。近年来有越来越多的研究结果发表在国外SCI收录的杂志上，引起了国际上广泛的关注。1重组蛋白1.1活性多肽1.1.1志贺毒素抑制多肽志贺毒素是痢疾志贺菌的主要毒力因子，是一种烈性蛋白质毒素。以制备的重组志贺毒素B亚单位(StxB)为靶标，利用噬菌体展示亲和淘选技术的4轮筛选，从随机十二肽库中筛选到与StxB结合的一批噬菌体克隆，对特异结合活性较高的27个噬菌体克隆的表面展示肽进行序列测定，克隆展示肽出现频率最高的A6噬菌体，在体外与志贺毒素孵育进行动物试验，动物存活率达33.3%，表明毒素的毒性得到部分抑制，A6短肽可能发展成为志贺毒素的拮抗剂[1]。1.1.2降钙素降钙素是甲状腺滤泡旁细胞产生的一种多肽类激素，它是体内钙平衡和骨代谢的调节因子，鲑降钙素已经在临床上用于骨质疏松症，但需要反复多次的注射，且与人降钙素的同源性仅为50%，易产生抗体。将人降钙素在成肌细胞中进行表达，能持续表达人降钙素的细胞进行微囊包埋后仍能持续分泌重组人降钙素到培养液中，这为利用包埋的重组成肌细胞释放人降钙素以及进一步采用移植细胞来治疗绝经后骨质疏松提供了可能[2]。降钙素基因相关肽(Calcitoningene-relatedpeptide，CGRP)是从甲状腺髓样癌细胞中克隆发现的一种神经肽，由降钙素基因初级转录产物选择性剪接产生，属于降钙素(Calcitonin，CT)超家族。CGRP有两种分子异构肽：αCGRP和βCGRP。采用大肠杆菌偏爱的密码子人工合成hαCGRP基因，构建了原核融合表达载体，对融合蛋白成功地进行了表达和纯化，Western免疫印迹验证该蛋白具有αCGRP抗原性，为下一步hαCGRP纯品的获得及动物实验的研究奠定了基础[3]。1.1.3葡萄糖依赖性促胰岛素多肽GIP，即葡萄糖依赖性促胰岛素多肽或抑胃肽(glucose-dependentinsulinotropicpolypeptideorgastricinhibitorypeptide)是由42个氨基酸组成的胃肠调节肽，具有广泛的临床应用价值。人工合成具有大肠杆菌偏爱密码子的编码GIP成熟肽的cDNA序列，利用pET32a(+)系统进行原核表达。诱导表达的rhGIP占细胞总蛋白质的35%，纯化后的10TrendsInBIo/PharmaceuTIcalIndusTry|2-2008TrendsinBio/PharmaceuticalIndustryrhGIP具有免疫活性，大鼠实验证实其具有抑制胃酸分泌和降低大鼠血浆血糖浓度的生理活性，并且对神经细胞有营养和保护作用[4]。1.1.4bFGF抑制多肽bFGF，又称FGF-2，即碱性成纤维细胞生长因子。利用肽类新药开发的重要工具—噬菌体展示技术，以Balb/c3T3细胞为靶标，以COS-7细胞作消减，对噬菌体随机七肽库进行4轮生物淘洗，再采用ELISA检测单克隆噬菌体对Balb/c3T3的亲和性和特异性，选取阳性克隆进行DNA测序分析。得到2段bFGF的受体结合模拟肽，有望作为bFGF抑制剂的先导肽，为bFGF肽类抑制剂的研发提供实验基础[5]。1.1.5人胰高血糖素样肽人胰高血糖素样肽-1(humanglucagon-likepeptide-1，hGLP-1)是肠降糖素(incretin)中的主要成分。将人工合成的hGLP-1基因插入质粒载体pET-32a(+)中，构建成rhGLP-1与硫氧还蛋白(thioredox)及六聚组氨酸(hexahistidine)的融合表达载体pET32-GLP-1，转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株，经IPTG诱导表达及Ni离子亲和层析纯化等步骤得到rhGLP-1样品，纯度大于90%，等电点介于pH5.2~pH5.85之间。动物实验表明重组蛋白具有明显的降血糖活性和促胰岛素分泌作用。该研究使通过基因工程方法在微生物中大量表达hGLP-1成为获得该肽的一种新途径[6]。1.1.6抗菌肽传统的抗生素是通过抑制细菌的蛋白质或DNA的合成以及破坏细胞壁来发挥作用，其过程需要特殊受体，微生物很容易通过基因突变对药物产生抗性。抗菌肽作用机理不同于传统抗生素，一般是通过物理作用造成细胞膜的穿孔，不需要特殊的受体，不会导致抗药菌株的产生，因此极有希望开发成为新型的多肽类抗生素。昆虫抗菌肽是昆虫体液免疫的重要成分，具有分子量小、对热、广谱抗菌等特点。自从惜古比天蚕(Hyalopheracecropia)的蛹中分离出第一个昆虫抗菌肽天蚕素(Cecropin)之后，陆续又从家蚕、蚊虫等昆虫体内分离出了很多抗菌肽，它们基本都为碱性的阳离子多肽。通过浸提、吸附、洗脱、层析等方法，配合杀菌活性检测手段，从家蝇蛆中分离纯化出一组弱酸性抗菌肽，对苏云金芽孢杆菌等革兰氏阳性菌和几种革兰氏阴性菌有强烈的杀灭作用，并有很强的耐热、耐冻融的特性。通过电洗脱进一步纯化出该抗菌肽MD7095，其分子量为7095Da，等电点为5.59，为一新肽，扫描电镜超微结构观察表明其杀菌机制主要是使细胞膜穿孔，内容物外泄，最终使细菌完全解体死亡[7]。防御素(defensin)是抗菌肽中较为重要的一种，主要来源于上皮组织,是正常机体抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线。猪的β2防御素1(porcineβ2defensin1,PBD21)广泛分布于消化道、呼吸道、肝肾等多种组织细胞内，在猪防御系统中有重要作用。根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子，在毕赤氏酵母中重组表达分子量约4.5kD的PBD-1，实现了PBD-1的分泌表达，体外抗菌研究表明，重组菌的培养上清对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性[8]。将家蝇防御素(Defensin)基因克隆到真核细胞构建了重组表达质粒，以阳离子脂质体为载体转染非洲绿猴肾细胞株COS-7细胞，表达产物经亲和层析纯化后体外试验表明其对大肠杆菌具有明显的抗菌活性[9]。Perinerin是一种分离自亚洲海蚕Perinereisaibuhitensis的结构新颖的抗菌肽，其对革兰氏阳性和阴性细菌均表现出强大的抑制作用；尤其对临床常见的耐药性绿脓杆菌更有明显的抑菌作用。采用巴斯德毕赤酵母表达系统，对海蚕抗菌肽perinerin进行分泌性重组表达,并经超滤和阳离子交换层析进一步纯化。生物学活性检测证实重组蛋白对金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌均具有明显抑制作用[10]。Hepcidin是2000年发现的一个主要在肝脏表达的含有8个半胱氨酸的小分子多肽，和许多富含半胱的抗菌肽类似具有显著的抗菌作用。重组融合hepcidin经金属螯合初步纯化后，先在cysteine/cystine氧化还原体系中氧化形成二硫键，再经凝胶过滤,稀释复性，酶切后可得到重组hepcidin。总收率50%,纯度大于95%。和先切除载体蛋白,再氧化复性的方法相比,这种方法可以节省50%肠激酶[11]。1.1.7内毒素结合肽革兰阴性菌外膜的主要成分LPS是脓毒症发生的主要触发因子，其活性中心lipidA分子富含负电荷磷酸基团，构建带正电荷的肽类通过静电作用与其结合中和其毒性，可减少细胞因子释放。对一内毒素结合肽(EBP)进行突变，以期通过增加正电荷数来增加其抗内毒素活性，并诱导相应基因得到高效融合表达。酶切获得目的片段并分离纯化后纯度大于95%。为进一步研究其生物学功能奠定基础[12]。1.1.8线虫抗凝肽线虫抗凝肽(nematodeanticoagulantpeptide,NAP)是自犬钩口线虫成虫体内分离得到的一系列具有抗凝作用的小分子多肽类物质，其中NAP5的抗凝活性最强。NAP5含77个氨基酸，通过与凝血因子FactorX/Xa的活性位点结合来抑制其活性，具有丝氨酸蛋白酶抑制作用，可抑制TrendsInBIo/PharmaceuTIcalIndusTry|2-200811ChinaBiopharmaProgress凝血酶原酶的形成，在脓毒血症、弥散性血管内凝血、膝关节完全置换术后防治静脉血栓栓塞等急性血小板相关性动、静脉血栓的预防和治疗中具有良好的临床应用前景。在毕赤氏酵母中分泌表达重组线虫抗凝肽，酵母培养上清中的重组NAP分子量比预计分子量稍大，可能与糖基化有关。体外活性检测证实其有较强的抗凝活性[13]。1.1.9抗栓肽抗栓肽(Decorsin)作为一种抗血栓药物，其作用靶标与水蛭素不同，水蛭素是凝血酶抑制剂，而抗栓肽是血小板聚集的抑制剂。它由39个氨基酸组成，其内部含有一个三肽Arg-Gly-Asp(RGD)序列，并且有三对保守的二硫键，重组表达量一般比较低，而且复性时易发生错配。用基因工程的方法获得抗栓肽基因并采取了与大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)基因融合表达的策略，在大肠杆菌中获得了可溶性表达，表达量占菌体总蛋白的35%。纯化的蛋白在体外实验中表明其具有显著的抑制ADP诱导的血小板聚集活性，抑制常数IC50为500nmol/L，完全抑制浓度≤2.5µmol/L，与天然抗栓肽活性相似[14]。1.1.10α1胸腺肽α1胸腺素是分离自胸腺素F5的具有激活T-淋巴细胞的活性多肽，在治疗乙肝、丙肝、多种肿瘤及艾滋病等方面有潜在的疗效，但其在胸腺素F5中的含量只有0.6%，尽管α1胸腺素只有28个氨基酸，但化学合成的成本还是较高。将重组α1胸腺素在大肠杆菌中表达，在周质空间中获得了高效的可溶性表达，表达量占周质蛋白总量的64.7%[15].1.1.11水蛭素水蛭素(hirudin)是从水蛭中分离出的抗凝血活性成分，是凝血酶的天然抑制剂，有多种变异体。运用DNA家族改组技术构建了噬菌体展示的水蛭素改组文库，经凝血酶亲和淘选，ELISA筛选得到了高活性的水蛭素变异体。将水蛭素变异体在大肠杆菌中进行重组表达，得到了一个活性高于野生型水蛭素HV2的突变子，并研究影响水蛭素活性的重要氨基酸位点[16]。水蛭素作为新一代抗凝剂，有望在临床上取代肝素，但其会引起出血倾向副作用尚没有好的解决办法。依据血栓形成的生理生化机制，用PCR方法将凝血因子FXa识别氨基酸序列嵌合到水蛭素结构基因的氨基端，纯化的重组蛋白小鼠尾部血栓模型实验表明，此新型嵌合抗栓剂由于在水蛭素的N末端与凝血因子FXa识别位点的短肽相融合，使得融合蛋白在非血栓部位不表现出抗凝血活性，而在血栓部位，水蛭素被从融合蛋白上切割下来发挥抗凝血作用，这样可以在不减少水蛭素抗凝血活性的同时，大幅度地降低出血副作用，在临床上具有非常重要的意义[17]。1.1.13胰岛素模拟肽胰岛素在治疗I型和II型糖尿病方面发挥了重要作用，但作为药物有其固有的缺点，比如蛋白质分子量大、易聚集导致效用下降、具有较强的抗原性等，而研究保留蛋白质生物活性位点的小肽可以在一定程度上克服生产和使用上存在的问题，不失为开发药物的又一途径。以胰岛素多克隆抗体为靶，对噬菌体展示随机C7C环肽库进行胰岛素相关肽的筛选，经过三轮筛选和ELISA结合，获得了两条序列，体外生物学活性检测表明小肽CPTSQANSC能够模拟胰岛素的功能，竞争性的抑制胰岛素与其受体的结合，体内实验表现出明显的降血糖作用。而另一小肽CVQPSHSSC则表现出胰岛素拮抗活性，会引起正常小鼠血糖升高。值得注意的是，