【精选资料】单克隆抗体的制备

单克隆抗体的制备一、单克隆抗体技术的原理B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthineH，氨基喋呤AminoopterinA及胸腺嘧啶核苷ThymidineT），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。单克隆抗体与常规的血清抗体的性质比较,见下表:性质常规血清抗体单克隆抗体抗体含量少μg/ml多mg/ml无关的Ig多少或几乎无其它血清蛋白有少，培养物上清常有10％胎牛血清Ag-Ab结合免疫原的全部成分的全部抗原决定簇免疫原中的一种成分的一个抗原决定簇特异性亲和力的重复性不同批号间有变化无变化与其它抗原的交叉反应与带有共同抗原决定簇的抗原有部分交叉一般无。结合到共同决定簇则是完全的免疫球蛋白的种类与亚类完全是混合的只是一种或几种免疫球蛋白的物理性质典型光谱抗体的单一性质在开展杂交瘤细胞技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列设备：主要仪器：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。主要器械：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备等。二、制备单克隆抗体的基本技术流程1、抗原制备从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。2、动物免疫免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。免疫程序的确定一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。1．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。2．颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。3、细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后把培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。（1）主要试剂的配制细胞培养基：主要有RPMI-1640或DMEM两种基础培养基培养基种类培养基成分不完全RPMI-1640培养基RPMI-1640培养基原液96ml、100×L.G.溶液、1ml双抗溶液1ml、7.5%NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml不完全DMEM培养基DMEM13.37g、超纯水或四蒸水980ml、NaHCO33.7g、双抗溶液10ml、100×L.G.溶液10ml完全RPMI-1640或DMEM培养基不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml、小牛血清15-20mlHT培养基完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml、HT贮存液1mlHAT培养基完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml、HT贮存液1ml，A贮存液1ml.溶液种类配置方法氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L）称取1.76mg氨基喋呤（AminopterinMW440.4），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH0.5ml中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L)称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW242.2)，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L）称取2.92gL-谷氨酰胺（L-glutamine，MW146.15），用100ml不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。青、链霉素（双抗）溶液（100×）取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20℃冻存。7.5%NaHCO3溶液称取分析纯NaHCO37.5g，溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4℃保存。HEPES溶液（1mol/L）称取23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonicacid，N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW238.3）溶于100ml超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。8-氮鸟嘌呤贮存液（100×）称取200mg8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW152.1），加入4mol/LNaOH1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中（即终浓度为20ug/ml）。⑵骨髓瘤细胞的准备骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下：a、于融合前48-36小时，将骨髓细胞扩大培养（一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备）。b、融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下，收集于50ml离心管或融合管内。c、1000r/min离心5-10min，弃去上清。d、加入30ml不完全培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基，混匀。e、取骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞数×105/4；或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×106/2⑶脾淋巴细胞的准备1．材料(1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。（2）1640培养液（3）2.5％FCS－1640营养液2．操作方法(1)拉颈或用CO2处死小白鼠。（2）将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。（3）把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。（4）用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。（5）直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。（6）以2.5％FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。（7）把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。（8）重复⑹、⑺步骤。（9）计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80％为合格。（4）饲养细胞（Feedercells）的制备在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feedercell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。1．材料（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。2．操作方法（1）拉颈处死小鼠。（2）70％酒精浸泡消毒10min。（3）用手术剪将小鼠腹部剪开