T淋巴细胞亚群CD4、CD8、CD3 细胞检测临床应用技术讲座

上海汇中细胞生物科技有限公司-学术部T淋巴细胞亚群CD4、CD8、CD3细胞检测2013年3月临床应用技术讲座免疫功能量化指标众所周知，体育锻炼能提高免疫功能，冬虫夏草能提高免疫功能，免疫球蛋白能提高免疫功能，蜂胶、螺旋藻亦能提高免疫功能…然而免疫功能是什么？免疫功能是否有效提高？提高到多少？缺少科学客观的量化指标！科学关注”食管癌患者存在着细胞免疫功能抑制，了解T淋巴细胞的免疫活性状态,对研究肿瘤的生物学行为具有重要意义。“——《癌症》2005年第24卷07期“冬虫夏草制剂加化疗组化疗后，可以改善化疗所致的免疫功能低下。”——《齐齐哈尔医学院学报》2006年12月第27卷17期”急性运动、有氧运动和长期适量运动与人体运动免疫调节产生非常重要联系，对T淋巴细胞及其亚群的免疫功能有重要影响“——《中国临床康复》2003年第7卷18期免疫功能，我们究竟了解多少？以癌症为例：正常人每天都会产生100～200个原癌细胞，体内免疫系统能及时发现并消灭它们。若人体免疫机能下降，便无法有效清除癌细胞，细胞大量增殖最终形成肿瘤。免疫功能——人体抵御外来病原体侵袭、进行自我保护的一种能力。免疫功能，人体免疫防护伞如肿瘤，80%以上肿瘤的发生，是因为人体免疫功能长期低下。肿瘤在免疫功能低下的情况下，易发生转移、复发……目前通常针对天平一端，如癌细胞进行各种检测，如：癌胚抗原、甲胎蛋白等肿瘤标志物、或早期癌细胞PET-CT检测；对天平另一端：免疫功能，多以白细胞检测为主，缺少CD3/4/8细胞计数此类精细化检测项目。——人体大部分的疾病与免疫功能低下有关！免疫功能，精细化检测免疫系统简介免疫系统免疫器官（胸腺、骨髓、淋巴结等）T淋巴细胞B淋巴细胞NK细胞巨噬细胞、粒细胞等CD3CD4CD8T淋巴细胞（电镜图）免疫系统，是人体抵御病原体入侵最重要的保卫防护系统，由免疫器官、免疫细胞，以及免疫分子组成。免疫分子（抗体、细胞因子等）免疫细胞T淋巴细胞—细胞免疫通过效应T细胞分泌穿孔素等，摧毁侵入到寄主细胞内的病毒、胞内寄生菌或外来的组织团块、癌变的细胞等。B淋巴细胞—体液免疫通过效应B细胞分泌抗体，与抗原发生特异性结合，清除的是游离在寄主细胞外的抗原及其产生的有毒物质。体内许多免疫反应如微生物(病毒、结核菌、真菌、原虫)的抗感染免疫、迟发型变态反应、抗肿瘤作用、移植排斥反应、细胞内寄生虫等，都是由细胞免疫主导。免疫细胞细胞免疫主力军–T淋巴细胞CD4细胞，诱导/辅助性T细胞，人体免疫系统最重要枢纽细胞，又被称作“人体免疫系统的司令官”。CD3细胞，成熟T淋巴细胞，表示人体总T细胞水平，反映免疫功能状况。CD4/CD8比值，临床诊断敏感指标，CD4与CD8相互制约共同作用，比值异常，可迅速判断人体免疫功能发生紊乱。CD8细胞，抑制/细胞毒性T淋巴细胞，能直接识别并杀伤致病细胞，与CD4协作抵御外侵。目前已发现CD系列细胞有近百种，在人体细胞免疫中起重要作用（并具有临床意义）的主要是CD3、CD4、CD8等细胞。正常参考值：CD3：770-2860/ulCD4：414-1440/ulCD8：238-1250/ulCD4/CD8：0.7-2.87汤钊猷中国工程院院士，全国重点学科肿瘤学学科带头人，著名肝癌专家，复旦大学肝癌研究所所长“对待癌症，除针对性治疗外，一定要努力改造自己，让自己提升免疫功能，才能在抗癌战争中占有利地位和优势。”2011年诺贝尔生理学或医学奖授予美、法、加三位科学家在免疫系统方面的研究。“免疫学是距离临床最近的学科，它涉及整个人体、每个细胞，在人类破解生命与疾病之谜道路上，发挥不可估量的作用。”免疫，不可或缺的诊断免疫，不可或缺的诊断曹雪涛中国工程院院士、中国医学科学院副院长兼医学免疫学国家重点实验室主任免疫学的研究成果已经渗透到临床的几乎每一个角落，应用免疫学技术和方法研究疾病发病机制以寻找可以应用于诊断、治疗和预防疾病的新方法、新试剂、新药物越来越得到重视。技术背景&项目起源比尔·梅琳达·盖茨基金会成立CD4专项基金，全球征募具有简单、廉价、快速、有效特性的CD4细胞检测新方法。仪器投资大配套试剂贵工作条件苛刻操作人员要求高……制约瓶颈和焦点：CD4细胞检测传统CD检测方法：流式细胞法，被美国垄断。技术背景9月相关论文发表于AmericanBiotechnologyLaboratory期刊2002年5月，作为唯一一家中国企业参展国际生物大会。梦起圣地亚哥2002年8月回国，开始该项目的研发180多日的失败、实验条件的限制、实验理论饱受质疑、资金短缺……重重问题让研发举步维艰!艾滋成为坚持的动力——不仅仅是为一个期待的眼神，更是为一个生命的延续。一间不足十平米的工作室一台古老的反光单目显微镜一个陈旧的超净工作台艾滋成为动力特异性抗体事先包被在芯片基板上，样本中表达有该特异性抗原细胞与芯片接触反应后，特异性细胞便被分离固定，再通过自动计数仪对固定细胞分析。CD3/4/8细胞检测玻片技术原理室温操作保存无需冷藏长期保存，可随时随地复查操作时间短易掌握低成本静脉、末梢血均可仪器自动读数可视化分析优势特点2006年，“MeasuringCellularMetabolismofImmobilizedCells”正式获得美国专利局批准（PATENTNo.US7141369）SoloInventor:CaoBo以下三个美国专利，对该平台技术构成了一个完整知识产权保护体系。专利一：“MeasuringCellularMetabolismofImmobilizedCells”专利二：“Measurementofthecellactivityandcellquantity”专利三：“Methodsandkitsfordetectingatargetcell”2010年，“Methodsandkitsfordetectingatargetcell”正式获得美国专利局批准（PATENTNo.US7855068）SoloInventor:CaoBo美国专利北京协和医院、北京佑安医院、武汉大学附属人民医院1300余例临床验证结论：SemiBio细胞免疫芯片与流式细胞仪相关性为0.95以上。上海中山医院、上海市公共卫生中心、上海市第六人民医院临床验证机构临床验证医疗器械生产企业许可证医疗器械注册证QMS考核报告新药证书上海医学科技奖美国专利2010中国国际工业博览会创新奖资质认证政府支持2004年上海市科委生物技术基础课题研究项目2005年上海市科委重大专项科技攻关项目2006年国家科技部创新基金2007年中小企业科技部创新资金2008年获上海医学科技奖2009年上海生物医药产业转化项目2009年上海高新技术成果转化项目2010年上海市科委“科技创新行动计划”生物医药领域重大专项2010年获中国国际工业博览会”创新奖“2011年通过WHO世界卫生组织-南非国家实验室（NHLS）泛非认证2012年第19届美国华盛顿“世界艾滋病大会”参展并发表大会论文该技术被作为新技术收录于WHO2007版《LaboratoryGuidelinesforenumeratingCD4TLymphocytesinthecontextofHIV/AIDS》中，成为对艾滋病提供有效的诊断和治疗手段的技术参考。对美国CDC实验室、南非卫生厅等相关技术人员进行该检测方法的培训。2011年4月，顺利完成南非国家实验室（NHLS）泛非认证国际应用◆Abiochipforspecificcellseparations.AmericanBiotechnologyLaboratory,September2002,28◆AbiochipforCD4cellcount.The2ndInternationalAIDSSocietyConference,July2003,Paris◆HIVtestingtechnologiesaftertwodecadesofevolution.IndianJMedRes121,April2005◆LaboratoryGuildelinesforenumeratingCD4TLymphocytesinthecontextofHIV/AIDS.WHOJun,2007◆一种CD4细胞计数方法.第二届亚洲检验技师学术大会,2005◆细胞芯片法测定健康体检人群全血中CD4细胞的临床应用价值.实用医学杂志,2007,23(20)◆加味玉屏风汤对提高慢性病患者CD4指标临床观察.上海中医药杂志,2007,41（10）◆玉屏活血汤提高老年气虚证患者CD4+T细胞临床研究.江西中医药,2011,8(41)◆老年冠心病患者免疫反应的研究.检验医学,2011,26（12）……发表论文CD3/4/8玻片检测与流式比较技术分析比较项目流式细胞仪法CD3/4/8玻片检测法试剂保存条件冰箱保存，需冷链常温保存，易运输血样要求需静脉血，用血量大手指末梢血或静脉血，用血量小样本准备样本前处理需标抗、裂解、洗涤、离心等步骤稀释全血样本，无需前处理仪器操作受样本前处理效果、软件参数设置影响较大（电压增益、设门范围、阴性定界、荧光补偿等）一键完成检测结果细胞相对百分比细胞绝对计数+形态图像分析（图文报告，含诊断结论）样本保存一次性废弃，不可保存长期保存，可随时复检SemiBioAssay细胞免疫芯片FCM流式细胞法………目前，细胞免疫相关检测在临床科室少有开展，滞后于日趋上升的临床需求。革命性突破临床应用临床应用通过CD3、CD4、CD8T细胞检测掌握疾病发病机制中，免疫参与程度，制定“免疫治疗”方案在肿瘤、感染性疾病、心肺疾病、自身免疫性疾病、各种原因导致的免疫功能低下等疾病中广泛应用。掌握疾病治疗过程中，免疫动态变化，评估治疗风险、用药药效、及机体恢复程度掌握亚健康人群，免疫水平及变化，筛查肿瘤等重大疾病隐患（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）（明显）临床应用临床应用肿瘤科应用：肿瘤科恶性肿瘤的发生、发展、转移与人体免疫功能下降密切相关。人体的抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，体内发挥抗肿瘤免疫作用主要由CD4和CD8细胞完成。CD4细胞能促进效应细胞抗肿瘤作用；CD8细胞则主要起相反免疫抑制作用；机体处于肿瘤状态，体内组织胺水平升高，激活CD8（抑制性T淋巴细胞）分泌抑制因子，抑制CD4（辅助性T细胞）和B细胞增殖与分化，从而抑制机体免疫功能。1、肿瘤患者处免疫抑制状态，T淋巴细胞降低。CD4CD4/CD8CD32、肿瘤患者T淋巴细胞与病程相关，随病程逐渐降低。CD3、CD4、CD4/CD8细胞数下降程度：Ⅳ期Ⅲ期Ⅱ期Ⅰ期应用：肿瘤科摘自：《肿瘤学杂志》2004年第10卷第3期【临床案例】42例肺癌患者，转移患者CD3、CD4及CD4/CD8比值均显著低于未转移患者及正常组。3、肿瘤患者T淋巴细胞持续低下，转移率高、易复发。在化疗或放疗或手术前，及时给予免疫增强同步治疗，有助于提高疗效。组合治疗：化疗中，同步给予免疫增强剂（如干扰素、左旋咪唑等）后，CD8下降，CD4、CD4/CD8升高，机体自身抗肿瘤免疫效得到有力发挥，患者恢复良好。4、肿瘤患者的化疗、放疗、手术治疗会导致免疫抑制。杀伤或切除肿瘤细胞同时具有非选择性杀伤作用，会损害机体细胞免疫功能。应用：肿瘤科应用：肿瘤科T细胞CD4、CD8、CD3检测介入时间1、入院基础检测（了解患者免疫功能初始状态）2、放疗、化疗、手术前检测（评估治疗前免疫状态，预测疗效及风险）3、放疗、化疗、手术后检测（评估治疗后免疫改善状况）4、出院前检测（预后判断）5、易转移、复发，每月跟踪检测（判断是否发生转移、复发）全国现有三级医院约1300家，二级医院约6500家，其中80%以上无流式细胞仪。同时由于流式成本昂贵、操作繁琐，CD3/4/8数量及比值检测，虽然对于肿瘤治疗意义重要，但临床基本未开展。世界新发肿瘤病人20%在中国卫生部统计资料表明：中国年均