中药对MCAO大鼠脑巢蛋白表达的影响

，王新陆2，胡怀强21青岛大学医学院中医教研室（266021）2山东中医药大学（250014）摘要：目的：研究中药复方对大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠脑内巢蛋白的影响，探讨其促进神经发生的作用。方法：30只大鼠随机分为药物组、病理模型组、正常对照组3组。用Tamura法造成MCAO大鼠模型，于造模成功后6天药物组灌胃给予中药复方复健片10g/kg，余二组分别灌胃给予同等量生理盐水，日1次，共2周。用免疫组化法观察MCAO大鼠脑内巢蛋白的表达。结果：药物组大鼠脑内巢蛋白表达明显增强。结论：中药复方复健片可显著增强MCAO大鼠脑内巢蛋白的表达，从而促进缺血性卒中神经发生。关键词：中药；缺血性卒中；巢蛋白复健片是我们临床治疗缺血性卒中的经验方，具有滋补肝肾作用，是纯中药制剂。临床研究表明，复健片可有效治疗缺血性卒中，改善患者的神经功能缺损评分、日常生活活动能力、智能状况和胰岛素抵抗状态，还可增加梗死周围组织及对侧的局部脑血流[1]。为探讨其作用机制是否与神经发生有关，我们进行了深入的实验研究。1实验材料1.1实验动物：普通级健康Wistar大鼠30只，12周龄，体重300±20g，雌雄不限（山东省实验动物中心提供）。单笼饲养一周，自由饮水和摄食。饲养室温度24-25℃，相对温度7%左右，光照明暗比为13：11。1.2实验仪器：显微手术钻，XSZ-2型，上海光电公司；双极电凝器，SJ-2型，上海光电公司；WT11001R型电子天平，江苏省常州市万得天平仪器厂；电热恒温水槽，DK-600型，上海精宏实验设备有限公司；手术显微镜，光学显微镜均为上海医用光学仪器厂产品；大鼠固定器。1.3实验药品及试剂：巢蛋白（nestin）免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；戊巴比妥钠购自上海化学试剂采购供应站分装厂；注射用青霉素钠购自山东鲁抗医药股份有限公司；氯代三苯基四氮唑（红四氮唑，TTC）购自上海试剂三厂。2实验方法2.1动物分组：实验动物随机分为药物组、病理模型组、正常对照组3组，每组10只。模型组和药物组按下述方法制作大脑中动脉闭塞（middlecerebralarteryocclusion，1基金项目：国家自然科学基金（No.30171165）1）模型，假手术组大鼠行同样开颅术，但不凝闭大脑中动脉，其余操作同模型组。2.2大鼠MCAO模型的制备：按Tamura[2]的方法稍加改进行右侧近端大脑中动脉电凝术。麻醉醒后24h内出现（1）左侧肢体痛刺激收缩现象消失；（2）向左侧倾倒或转圈；（2）提尾时左上肢不能向前伸直。具备以上3项为MCAO模型复制成功，纳入试验，进行分组，余者弃之。2.3给药方法：药物组灌胃给予复健片（由山东鲁信药业有限公司生产，主要药物为何首乌、草决明、桑寄生、海马、淫羊藿等）水溶液10g/kg，余二组分别灌胃给予同等量生理盐水，日1次，共2周。于造模成功后6d给药，固体饲料和水自由摄取。2.4切片制作：实验动物结束喂药、末次观察神经系统症状后，迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管后，先用100ml生理盐水快速冲洗，随后用4%多聚甲醛磷酸缓冲剂心脏灌注约30min，灌毕立即取脑浸入上述固定液1d，常规脱水、浸蜡、包埋。予正中隆起水平在切片机上行4μm连续冠状切片备用。2.5巢蛋白表达：采用免疫组织化学法（ABC法）进行观察。（1）免疫组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡复水；30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温5～10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗10min×3次；滴加复合消化液10min，蒸馏水洗3次；滴加正常山羊血清封闭液20min，不洗，甩去多余液体；滴加兔抗鼠Nestin一抗（l:2000，Sigma），室温下（25℃）孵育2小时，再4℃过夜，PBS洗2min×3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温下20min，PBS洗2min×3次；滴加试剂SABC复合物，室温20min，PBS洗5min×4次；DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般10分钟左右。蒸馏水多次洗涤；苏木素轻度复染。脱水，透明，中性树胶封片。显微镜观察。（2）免疫组织化学染色对照：用正常山羊血清和PBS代替Nestin一抗作孵育，其余步骤同上，用以检查Nestin免疫反应的特异性。2.6图像分析方法全部测量均在相同光学条件下完成。采用LeicaQwinV3图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析，测定染色平均灰度。2.7统计学方法将所有数据输入IBMPC机，应用SPSS10.0软件包进行统计分析。组间计量资料比较采用方差分析，相关分析采用等级相关检验。3实验结果复健片对MCAO大鼠巢蛋白表达的影响见表1及图1-5。2表达的影响（—X±S）组别样本量时间染色平均灰度假手术组5176.34±6.295给药1w后185.42±6.23※模型组4给药2w后183.51±8.29※※5给药1w后192.28±3.55△药物组5给药2w后201.90±5.59△△注：与假手术组比较，△、△△P均＜0.01，※、※※P均＜0.05；与组内前期比较，△△P＜0.05，※※P＞0.05；组间同期比较，△P＞0.05，△△P＜0.01。结果显示，药物组和模型组的Nestin染色平均灰度较假手术组均有显著差异；组内比较，药物组治疗2周后较治疗1周后有显著差异，模型组则无显著差异；组间比较，治疗1周后，药物组和模型组无显著差异，但治疗2周后产生了显著差异。4讨论中枢神经系统损伤后的神经发生与后期康复效果密切相关[3]，神经干细胞的增殖是神经发生的关键因素。传统使用的神经干细胞标记方法大体分为两种：一种是将外源性示踪基因如LacZ基因或绿色荧光蛋白基因转染到神经干细胞内[4-5]，该方法具有技术要求高、操作复杂、时间和资金消耗较大、外源基因可能影响神经干细胞自身的生物学活性等缺点；另一种方法是使用5-溴脱氧尿核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）掺入分裂增殖的神经干细胞的染色质，使用该方法研究内源性的神经干细胞时，需要对实验动物进行大剂量、长期、反复的BrdU腹腔内注射以产生较高的细胞阳性标记率，有全身毒性大、操作费时费力等不足[6]。纵观表达巢蛋白的细胞类型可发现，巢蛋白主要在未分化、具有分裂能力的神经细胞表达，且有一定的时间段；其表达起始于神经板的形成，在神经迁移和神经分化开始后逐渐消失，一旦神经前体细胞朝向终末方向分化成神经元和胶质细胞（如星形胶质细胞）时，巢蛋白便停止表达。因此，nestin是神经干细胞的特异性标记蛋白，在神经干细胞鉴定中被广泛应用[7]。还有研究结果显示[8]，神经干细胞在分化后的6周之内巢蛋白染色仍为阳性，随后即显著下降，从而使巢蛋白成为在此时间窗内神经干细胞自身固有的一种示踪剂，便于我们动态跟踪在体情况下神经干细胞的分化和迁移，有利于对中枢神经系统的生长发育以及损伤后神经干细胞的反应进行深入的研究。同上述两种标记方法相比较，通过检测巢蛋白的表达来示踪神经干细胞具有对细胞自身生物学活性无干扰、操作简便、费用低、阳性标记率高等优点。3复健片由何首乌、桑寄生、草决明、海马、淫羊藿组成，是用于缺血性卒中治疗的经验方。方中重施何首乌为君。本品味苦、甘，性微温，归肝肾经，善补肝肾、益精血，“治中风左半偏枯之病甚佳”（《玉楸药解》），故何首乌为治疗中风病传统要药。因此重用之以滋补肝肾、填益真阴。该方复配桑寄生、草决明为臣。二味同有滋补肝肾之功，共扶首乌固本培源。海马、淫羊藿均能温补肾元，方中稍佐此二味，意在激发肾气，和调阴阳，兼有通行气血之用。以上数味，相辅成功，补肝肾、调气血、和阴阳。本研究通过检测nestin的表达，探索复健片对神经元增殖的影响。研究结果显示，复健片可明显促进神经元的增殖，从而对神经发生起到一定干预作用。参考文献［1］周永红.复健胶囊治疗缺血性卒中后遗症30例临床研究.中医杂志，2002，43（5）：355-356.［2］TamuraA,GrahamDI,McCullochJ,etal.Focalcerebralischemiaintherat:Descriptionoftechniqueandearlyneuropathologicalconsequencesfollowingmiddlecerebralarteryocclusion.JCerbBloodFlowMetab,1981,1:15.［3］LiuY,DongWW,YuRH.TheneuroprotectiveeffectsofcerebellumelectricstimulationonmotoroutcomeandMEPinpatientsofacutecerebralstroke.ZhongguoLinchuangKangfu(ChinJClinRehabil),2002;6(11):1565-1566.［4］FranklinRJ,BayleySA,BlakemoreWF.TransplantedCG4cells(anoligodendrocyteprogenitorcellline)survive，migrate，andcontributetorepairofareasofdemyelinationinX-irradiatedanddamagedspinalcordbutnotinnormalspinalcord[J].ExpNeurol,1996,137:263～276.［5］EnglundU,BjorklundA,WictorinK,etal.Graftedneuralstemcellsdevelopintofunctionalpyramidalneuronsandintegrateintohostcorticalcircuitry[J].ProcNatlAcadSciUSA,2002,99:17089～17094.［6］LiuZ,MartinLJ.Olfactorybulbcoreisarichsourceofneuralprogenitorandstemcellsinadultrodentandhuman[J].JCompNeurol,2003,459:368～391.［7］LendahlU,ZimmermanLB,McKayRD.CNSstemcellsexpressanewclassofintermediatefilamentprotein[J].Cell,1990,60(4):585～595.［8］历俊华，安沂华，张绍东，等.巢蛋白在己分化的神经干细胞中表达时程的研究[J].中华实验外科杂志，2003，20（9）：838～840.4，WangXinlu2，HuHuaiqiang21QingdaoUniversityMidicalCollege（266021）2ShandongUniversityoftraditionalChinesemedicine（250014）AbstractObjectives:TostudytheeffectofcomplexofChineseherbontheexpressionofnestininthebrainofMCAOratsandexploretheactionmechanismofitspromotingneurogenesis.Methods:30ratswererandomlydividedintodruggroup,modelgroupa