中药指纹图谱研究

中药指纹图谱研究概况湖北中医学院药学院干国平博士2009.11引言中药指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式，其研究的方法和技术日趋成熟完善，是目前控制中药和天然药质量最有效的方法和手段之一。中药指纹图谱能从原药材的栽培、引种，中成药生产工艺的规范与优化，到产品质量标准的制定提供全方位的质量保证。引言日本汉方药在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制。美国食品药品管理局允许草药保健品申报资料时提供色谱指纹图。世界卫生组织在1996年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图以证明产品质量的一致性。1.我国研究中药指纹图谱的历史20世纪70年代：我国的学者尝试用UV、IR、TLC、GC进行中药的鉴别研究；1.我国研究中药指纹图谱的历史20世纪80年代~90年代：《中国药典》1995年版一部收载了TLC法鉴别中药材及中成药。《中国药典》2000年版一部中药薄层色谱鉴别引进了“对照药材”，以完整的色谱图像作为鉴别的依据而正式纳入国家药品标准。《中国药典》2005年版一部HPLC、GC广泛用于中药的定性、定量分析1.我国研究中药指纹图谱的历史痔疮栓中黄柏的TLC鉴别1.阴性对照2.样品3.黄柏对照药材逍遥丸中甘草的鉴别（1.阴性对照、2.样品3.对照药材）123甘草的来源：甘草GlycyrrhizauralensisFisch.胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根茎1.中药指纹图谱的历史2000年:国家药监局颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》。国家从行政管理的角度，正式要求已注册的中药注射剂须进行指纹图谱研究和纳入质量标准；规范了中药指纹图谱的研究，从而促进了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。2.中药指纹图谱的定义定义：运用现代分析技术对中药化学信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述。现代分析技术：TLC、TLCS、HPLC、HPLC-MS、GC、GC-MS、HPCE、IR、NMR、X-射线衍射、DNA指纹图谱等。主要是色谱技术。2.中药指纹图谱的定义表征和描述：“表征”是将中药化学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表达；“描述”是对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。分析比较的结果，是对供试品与对照品之间的差异或一致性作出评价。3.建立中药指纹图谱的目的和意义中药的特点：（1）中药化学成分的多样性与复杂性；（2）中药药效成分的非单一性；（3）中药质量的不稳定性。3.建立中药指纹图谱的目的和意义（1）对中药质量控制的补充和提高：现有质量控制模式：以1个或1个以上成分为控制指标，难以准确、全面地评价中药质量。指纹图谱从整体上评价中药的内在质量，已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。3.中药指纹图谱的研究目的意义（2）提高中药质量的稳定性控制原料、中间体、成品的一致性，减少批间差异，提高中药质量的稳定性。（1）系统性：尽可能多的覆盖全貌。指纹图谱反映的化学成分应包括中药有效所部位所含大部分成份的种类，或指标成分的全部。4.中药指纹图谱建立的原则（2）特征性：特征明显，专属性强。指纹图谱中反映的化学成分信息应具有高度的选择性，这些信息的综合结果，将能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的化学条码。4.中药指纹图谱建立的原则（3）重现性：重现性好。重现性是保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性的前提。4.中药指纹图谱建立的原则菝葜抗肿瘤活性部位指纹图谱的研究1.药材来源2.色谱条件3.供试品和对照品溶液的制备4.方法学考察5.指纹图谱及技术参数1.药材来源（10种菝葜、4种近缘品种）样品编号药材产地来源1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.2湖南靖州菝葜S.chinaL.3安徽坟天山菝葜S.chinaL.4广西宾阳菝葜S.chinaL.5广东省从化县菝葜S.chinaL.6重庆市马脚山菝葜S.chinaL.7浙江温州市永嘉县上塘镇菝葜S.chinaL.8福建仙游菝葜S.chinaL.9湖南岳阳菝葜S.chinaL.10江西樟树市让山菝葜S.chinaL.11江西弋阳小果菝葜（S.davidianaA.DC）12湖南长沙长托菝葜（S.feroxWall.exKunth）13湖北麻城黑果菝葜(S.glauco-chinaWarb.)14湖北咸宁土茯苓(S.glabraRoxb.)2.色谱条件：KromasilC18柱（4.6×250mm，5μm）流速:0.8ml·min-1进样量:20μL；检测波长:330mm；流动相:乙腈-甲醇-0.04％磷酸溶液梯度洗脱程序（V/V,%）时间（min）乙腈甲醇0.04％磷酸溶液010387301238532173806018379100283693.供试品溶液的制备样品粉末70％乙醇超声提取滤过，取续滤液蒸干残渣热水溶解乙酸乙酯萃取乙酸乙酯液甲醇定容微孔滤膜滤过蒸干残渣供试品溶液4.对照品溶液的制备精密称取黄杞苷对照品适量，加甲醇制成每ml含50μg的溶液。5.1精密度试验5.2稳定性试验5.3重现性试验5.方法学考察精密度和稳定性试验结果（相对保留时间）(n=5)峰号⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.2750.2760.2730.2730.2750.2740.4920.3940.3960.3960.3930.3960.3950.3630.4880.490.4910.4860.490.4890.4140.8010.8040.8030.80.8020.8020.2050.8520.8550.8550.8520.8530.8530.1860.9200.920.9180.9190.9210.9200.127（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0081.2691.2651.2551.2681.2711.2660.5091.3421.3531.3551.3531.3481.3500.39101.7111.7081.6961.7071.7011.7050.35111.7771.7831.7861.7821.7781.7810.21121.8251.8311.8351.8291.8251.8290.23精密度和稳定性试验结果（相对峰面积）(n=5)峰号⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD（％）10.7500.7570.7750.7730.7840.7681.8120.1770.1760.1690.1750.1760.1751.8430.3590.3590.3620.3590.3600.3600.3640.2310.2330.2200.2250.2340.2292.6050.2280.2210.2210.2240.2260.2241.3861.4531.4611.4321.4621.4881.4591.387（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0087.8627.8567.8407.8417.8407.8480.1390.2540.2570.2540.2550.2530.2550.60101.2701.2741.2721.2741.2741.2730.14110.2980.2910.2900.2940.2960.2941.14120.5780.5780.5740.5780.5770.5770.30精密度与稳定性试验结果：☆各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％;☆仪器的精密度良好；☆供试品溶液在12h内基本稳定；重现性试验结果（相对保留时间）(n=5)峰号⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.2750.2760.2750.2730.2780.2750.6620.3940.3960.3960.3960.3940.3950.2830.4880.490.490.4910.4890.4900.2340.8010.8030.8020.8030.8030.8020.1150.8520.8550.8550.8530.8520.8530.1860.920.9190.920.9210.920.9200.087（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0081.2691.2641.2651.2651.2651.2660.1591.3421.3531.3551.3531.3481.3500.39101.7111.7061.7061.7061.7061.7070.13111.7771.7821.7781.7811.7821.7800.13121.8251.831.831.8311.8311.8290.14重现性试验结果（相对峰面积）(n=5)峰号⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.750.7590.760.7630.7740.7611.1420.1770.1750.1790.1770.1770.1770.8030.3590.360.3590.3620.3590.3600.3640.2310.2230.220.2240.2240.2241.8050.2280.2240.2210.2270.220.2241.5861.4531.4611.4571.4591.4621.4580.257(S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0087.8627.8557.867.8497.8457.8540.0990.2540.2540.2560.2550.2530.2540.45101.271.2741.2721.2741.2731.2730.13110.2980.2930.290.2890.2970.2931.38120.5780.5750.5790.5780.5780.5780.26重现性试验结果：☆各共有峰相对保留时间的RSD均小于3％；☆各共有峰相对峰面积的RSD均小于3％；☆表明方法的重现性好。6.指纹图谱及技术参数6.1指纹图谱的制备6.2共有指纹峰的标定6.3共有指纹峰面积的比值6.4非共有峰面积的比值6.5主要指纹峰的归属6.6相似度分析6.1指纹图谱的制备分别精密吸取供试品溶液（10批菝葜正品及4批菝葜近源品种）各20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录90min内色谱图10批菝葜指纹图谱叠加图6.2共有指纹峰的标定以相对保留时间标定了12个共有峰S6.2共有指纹峰的标定(共有峰相对保留时间)峰号样品1234567(S)8910111210.2750.3940.4880.8010.8520.9201.0001.2691.3421.7111.7771.82520.2760.3980.4880.8000.8380.9191.0001.2721.3461.7081.7731.82030.2760.3950.4890.8040.8540.9241.0001.2761.3431.7101.7691.81640.2770.3940.490.8020.8520.9241.0001.2791.3451.7101.8061.82450.2750.3950.4890.8040.8530.9211.0001.2711.3381.6991.7671.81560.2760.3920.4710.7740.8560.9181.0001.2701.3411.6941.7681.79170.2740.3950.4850.8000.8520.9181.0001.2651.3321.6941.7681.79180.2770.3960.4890.7990.8500.9191.0001.2721.3401.7021.7691.81690.2730.3940.4850.8000.8490.9191.0001.2711.3421.7101.7741.805100.2760.3970.4900.8010.8380