等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用

等温滴定量热仪（ITC）在分子相互作用中的应用陈雍硕[e-mail]lorimetry等温滴定量热ITC:测定分子相互作用的方法在一次实验中,ITC可以测定•结合的亲和力常数(K),•结合反应中的焓变和熵变(∆H,∆S)•结合位点数(n)实验也可以测定有多个结合位点的样品-4-2000.51.01.52.0∆HNKdkcalmol-1ofinjectantMolarratio等温滴定量热仪(ITC)噪音0.5nanocal/second温度范围:2-80oC样品池体积:1.3mlor0.2ml量热池样品池对照池∆T1：样品池温度反馈神奇的微量热控制—功率补偿ReferenceCalibrationHeaterCellMainHeaterSampleCalibrationHeaterDP∆TSRTheDPisameasuredpowerdifferentialbetweenthereferenceandsamplecellstomaintainazerotemperaturebetweenthecells∆T~0IsothermalTitrationCalorimetry实验流程1)样品池中加入待测大分子2)参照池中加入缓冲液3)将待测配体吸入注射器中4)注射器置于样品池中5)调整温度、搅拌速度和每次注射体积典型ITC数据-40-200010203040Data:RNAHHH_NDHModel:1SitesChi^2=2795.38932N1.02眪0.00159K5.57E4眪1.01E3H-1.359E4眪29.18Time(min)µcal/sec0.00.51.01.52.0-14-12-10-8-6-4-20MolarRatiokcal/moleofinjectant上半部分表示每次注射采集的数据。下半部分表示每次注射的释放的热量（上图中每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比作图ITC理论基础∆G=-RTlnKB∆G=∆H–T∆S令人郁闷的公式说明了什么？1.相同的KD有着相同的∆G；2.相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。引发焓变和熵变的主要因素Entropy(+∆S)熵变Hydrophobicinteractions疏水作用Conformationalfreedom构象自由度非特异性结合Enthalpy(-∆H)焓变Hydrogenbonds氢键Ionicinteractions离子作用特异性结合ITC技术的应用领域分子相互作用：溶液中的几乎所有天然状态分子：包括蛋白质、核酸、多肽、药物分子、脂类、金属离子、小分子等等；工艺过程的开发和控制酶动力学药物研发非生物系统Tobromycinbindingtoaminoglycosidenucleotidyltransferase(2”)WithoutMgAMPCPPWithMgAMPCPPKD=0.64µM∆H=-18.2kcal/mole∆S=-34cal/mole/oKKD=0.21µM∆H=-12.6kcal/mole∆S=-12.3cal/mole/oK抗生素抗性的菌种为什么能更好的消灭抗生素WrightandSerpersu,Biochemistry44,11581-11591(2005)DNA形成了三螺旋？DNAtriplexformationA120µMsolutionof15-mersinglestrandedDNAwastitratedintoa5µMsolutionof23-merdoublestrandedDNAat25oCin10mMSodiumAcetate,pH4.8KD=1.1x10-8∆G=-10.8kcal/mole∆H=-83.8kcal/mole∆S=-24.5e.uKamiyaetal.,JACS118,4532-4538药物结合的热动力学特征-20-15-10-50510kcal/mole∆G∆H-T∆S一样的亲合力，不一样的微观世界MicroCalApplicationNote:ITCandDrugDesignHIV蛋白酶抑制剂开发的“成长烦恼”Unfavorable-20000-15000-10000-500005000IndinavirNelfinavirSaquinavirRitonavirAmprenavirLopinavirAtazanavirKNI-577KNI-272KNI-764TMC-126TMC-114∆G∆H-T∆Scal/mol12YEARSFavorableVelazquez-Campoyetal(2003)CurrentDrugTargetsInfectiousDisorders,3311Ohtakaetal(2004)Int.J.Biochem.CellBiol.361787ITC在小分子药物结构方面的优化抗疟疾新药就这样放弃吗？Kd=16nM∆H=-1.2kcal/molOptimizeEnthalpy,MinimizeEntropyCompensationONHNOHOOSNHOKd=76nM∆H=-6.0kcal/mol∆∆H=-4.8kcal/mol-T∆∆S=5.7kcal/molONHNOHOOSNHOHOKd=0.5nM∆H=-5.5kcal/mol∆∆H=-4.3kcal/mol-T∆∆S=2.2kcal/molONHNOHOOSNHOHOPlmIIInhibitorOptimizationFreire,DrugDisc.Today,13869(2008)酶反应动力学的研究传统酶分析法的局限性（连续分析法，不连续分析法，偶合分析法）1.溶剂不透明或有混浊并对光谱检测有干扰；2.天然的、重组的或突变的酶活性低于分析方法的检测限；3.产物或底物没有光谱基团或荧光基团，或者标记的成本太高或太耗时；4.不连续分析要求多步进行；5.不存在直接的偶合反应；6.偶合分析不精确；7.底物或酶活性不清楚；8.蛋白质功能不清楚。ITC的优点1.方法开发简单；2.只要反应过程中有热量变化，ITC即可作为普适的方法；3.是一项灵敏的技术-噪音水平0.01μcal/sec，利用现在的先进仪器可以获得很高的信噪比；4.无需带荧光或光谱特征的底物参与反应；5.单次实验即可获得数据；6.适用于研究多种类型的酶;7.可以用于不透明的样品;8.所得数据可以与其它方法进行比较；9.除了获得热力学数据外还可以获得动力学数据酶反应动力学的研究(不一般的ITC曲线）Kcat：催化速率常数KM：米氏常数酶反应动力学应用测量PP1-γ磷酸酶水解PNPPITC测量PP1-γ磷酸酶水解PNPP速度的原始数据PP1-γ磷酸酶水解PNPP的Michaelis-Menten曲线ITCApplicationsEnzymeKineticsTypicalconcentrations•Enzyme25-100pM•Substrate10-100μM(2-20μlperinjection;15-30injections)ToddandGomez,Anal.Biochem.296,179-187(2001)ITC产品iTC200样品池体积0.2ml10-15实验/8小时样品消耗是VP-ITC的1/7VP-ITC样品池体积1.4ml~4-5实验/8小时Auto-iTC200~50实验/天384个样品,无人化操控可由ITC200升级AvailableMid2008无与伦比的数据分析软件--Origin7多种独特的分析模式•酶动力学分析模式•替代模式•二聚体解离模式…….我们的客户—国内用户超过30家，全球超过1500家研究所中科院生化细胞所中科院生物物理所北京生命科学研究所诺华制药研发中心……大学中国科学技术大学2台复旦大学2台清华大学2台武汉大学南开大学中山大学华中师范大学浙江工商大学香港科技大学香港理工大学……Thanks!陈雍硕E-mail:[e-mail]:13918729620