中药鉴定学实验指导

中药鉴定学实验总论一、中药鉴定的法定依据二、药材鉴定取样法三、药材来源鉴定法四、药材性状鉴定法五、药材显微鉴定法六、药材理化鉴定法各论实验一组织制片技术一、目的要求(1)掌握徒手制片、粉末制片和表面制片的方法。(2)熟悉生物显微镜使用方法及作图要领。二、仪器、试剂及材料1．仪器生物显微镜、酒精灯、盖玻片、载玻片、镊子、解剖针、擦镜纸、吸水纸、火柴、绘图铅笔(HB、2H、4H)、直尺和橡皮，以上都是每次实验必备品。另需单（双面）刀片或剃刀、徒手切片器、培养皿。2．试剂甘油、水、水合氯醛试液、甘油醋酸试液、间苯三酚试液、浓盐酸，以上都是实验室必备试液。3．材料制作徒手切片和表面制片，可选用新鲜药材；制作粉末片，选用干燥药材的粉末。三、实验内容1.生物显微镜的使用生物显微镜由光学部分和机械部分组成。光学部分包括成像系统——目镜和物镜，照明系统——聚光器、可变光栏和反射镜。物镜将标本作第一次放大，目镜将第一次放大的像作第二次放大，两者相乘即是观察到的放大倍数。机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、粗细调节手轮及推动器或压夹。使用生物显微镜时，利用反射镜将外来光线导入聚光镜中，由聚光镜将光线会聚在标本上，用光栏调节光线强度。观察时视野范围内应均匀明亮，先用低倍镜观察，如需要放大，可将目的物调至视野中央，然后转换成高倍镜，仔细观察。低倍镜的操作方法①将显微镜放置离桌缘约10cm处，镜臂应靠近胸前。②对光。上升聚光镜到载物台水平，打开光栏至最大限度，再将低倍镜转至镜筒的正下方，使对准载物台上的透光孔（转动时，听到“得”一声，即已对正）然后用二手转动反光镜，同时从接目镜向下看，直至镜中出现一明亮而均匀的视野为止。③装片。将欲观察的标本片从镜前方横置于载物台上，（注意盖玻片应向上）使标本对准透光孔的中央。④调节焦距。从侧面注视接物镜与标本片之间的距离，旋转粗调节手轮，使镜筒慢慢下降（或使载物台慢慢上升），直至物镜几乎与标本片相接触，但切勿触及标本片，以免造成镜头与标本片的损坏。自目镜向下观察，同时旋转粗调节手轮，使物镜慢慢上升（或使载物台慢慢下降），直至在视野中看到物象为止。⑤看到物象后，若观看部分不在视野中心，则慢慢移动载片，使之适中，再转动细调节手轮，直至看到最清楚的物象为止。注意在显微镜中看到的是实物倒像。如果观察过程中发现清晰的图像逐渐模糊，说明调节手轮失灵，应进行检修。高倍镜的操作方法应先在低倍镜下选择物像，移至视野中心，换转高倍镜，应能看到欲观察之物像，转动细调节手轮使之图像清晰。更换高倍镜时如出现镜头触及载玻片现象，则要检查标本切片是否放反，或高低倍镜是否配套。高倍镜头观察物象时，只能用细调节手轮调节焦距。低倍镜下观察到的物象转至高倍镜下观察时，通常视野转暗，可调节聚光器和光栅以增加亮度。高低倍镜视野中心的校正：由于显微镜使用过久或使用不当，有时出现高低倍镜视野中心不重合的现象，影响工作效率，因此使用前应事先校对高低倍镜视野中心。方法是先在高倍镜中寻找一物，移至视野中心，转过低倍物镜，观察此物在低倍镜视野中所在的部位，记下座标位置，以后凡在低倍镜视野中找到的物体就移动至所记录的座标位置，转过高倍镜，正置视野中心。光源的调节观察不同的对象要使用不同强弱的光线，如观察无色的薄壁细胞、淀粉粒的层纹、细小的草酸钙晶体等需要较暗的光线；组织较厚的、有色的厚壁细胞等就需要较强的光线。调节光源有几种方法：①转动反光镜，凹面光强，平面光较暗（带电光源的显微镜可直接调节光线的明暗）。②升降聚光器，上升光强，下降光暗。③调节光栅，开大光强，关小光弱。④加滤光片。使用显微镜注意点①取拿显微镜时，必须一手握住镜臂，一手托住镜座，轻取轻放，防止因撞击使镜头内各组透镜脱胶而影响观察的清晰度。②每次观察标本片时，必须先用低倍镜观察，看清物象后，再换高倍镜。③要注意保持显微镜的干燥和清洁，使用前后，均需将显微镜擦干净，注意镜头要用擦镜纸或绸巾单向擦拂，切勿用手、手帕或纸片等去擦，观察临时制片时，要防止水分或药液外溢以致沾污镜头及其他部分。2粉末制片法此法是鉴定生药最常用的方法之一，简便快速，主要鉴别细胞的形态特征。粉末的制备选择具有代表性的样品适量，置粉碎器中，粉碎，使之全部样品通过0.17～0.25mm孔径的筛子（相当于药典4～5号筛），中成药则应通过0.15mm孔径的筛子（相当于药典6号筛），装于瓶中备用。注意：若有较多的组织（如纤维等）不能通过筛子，而作为残渣（头子）遗去，就会影响该药材特征的检出，造成结果判断的困难。特别坚硬的药材可用锉刀将其锉成粉末。粉末制片一般制片：取粉末少许，置于洁净的载玻片上，滴加1～2滴蒸馏水或甘油醋酸试液，用解剖针混合均匀，然后将盖玻片一侧边沿轻轻压在粉末旁载片上，慢慢放下，若盖下后润湿剂未充满盖片，则可在一侧滴加少量润湿剂，使之充满盖片；若润湿剂过多而溢出盖片外，则用滤纸屑从侧面将过多的润湿剂吸去，保持制片清洁，即可置显微镜下观察。可观察细胞中的不溶性物质如淀粉粒、脂肪油滴、色素颗粒等。凡含淀粉粒的粉末进行鉴定时，必须先按此法进行装片。水合氯醛处理制片：取粉末少许，置于洁净的载玻片上，滴加水合氯醛试液1～2滴，混合后在小火焰上来回加热，并以解剖针搅拌（切勿使溶液蒸干），补充2～3次水合氯醛试液，然后将处理的粉末集中一处，为防止水合氯醛结晶析出，滴加稀甘油混合后盖上盖玻片，用滤纸屑清洁盖玻片周围的多余药液，即可置显微镜下观察。水合氯醛试液可除去细胞中的淀粉，油脂等，增加细胞壁的折光率，还能使萎缩的细胞壁膨胀，从而使细胞的形态更加清晰。3．组织简图绘制要领常用的各种组织简图代表符号(1)绘图的一般原则：①一切结构均用线条来表示。线条要求粗细均匀，圆滑，明暗一致。②所有结构线条不能用尺或其他圆规或曲线板等工具代画，必须徒手作图，以表示生物的自然形态。③显示立体结构可用透视线条来表示。对球体、圆柱体或圆锥体的立体结构可以用圆点衬托明暗光线的方式，而不可用任何涂影来表示。点要小而圆，由密到稀逐步过渡。④各部位应先画出引线再注文字。引线用直尺画实线来表示，要求细直、均匀、不交叉，以免误指。图内的结构名称，可直接用文字写明，也可用数码代注，再在图下集中注明。注字书写要求清楚、端正。图下需注明标本的名称、部位和放大倍数。用显微目尺量出被测观察物在同一方向上的实际长度或大小(2)徒手绘图法的步骤：①选择最典型的标本或结构。②仔细观察各部位的形状和结构及其之间的比例关系和较明显的立体结构。③用较淡的铅笔(2H或4H)，按照实物或显微图像的比例关系和立体投影画出轮廓草图，经反复对照修改后，再用较浓的铅笔(HB或2H)绘出修改图。④画引线，注字。实验二显微测量和显微描绘技术（一）目的要求（1）掌握解离制片法。（2）掌握显微测微尺的校正和使用方法。（3）掌握描绘器的使用方法。（二）仪器、试剂及材料1.仪器XS系列显微镜、单（双）面刀片、烧杯、试管、目镜测微尺、载台测微尺、显微描绘器、绘图板、恒温水浴、量筒。2.试剂10%硝酸、10%铬酸、浓硝酸、氯酸钾、5%～15%的氢氧化钾溶液3.材料虎杖、麦冬等。（三）实验内容1．解离制片法2．显微测微尺的使用3．描绘器的使用及描绘图放大倍数的计算解离制片法系利用化学试剂使植物体的细胞与细胞间的中层物质溶解，细胞相互分离的方法。适用于研究细胞的立体形态结构，尤其适宜观察导管、管胞、石细胞和纤维等增厚壁的状况。欲解离的材料，需先切割成2mm的薄片。根据选用解离的试剂不同分为以下几种方法：氢氧化钾解离法硝酸-铬酸离析法氯酸钾法氢氧化钾解离法：适用于柔软的植物材料。将切割好的材料置于坩埚中，加5％氢氧化钾溶液适量，加热至用玻璃棒挤压能离散为止。如离析的材料稍硬，可用6％～10％氢氧化钾液加热使之离析，尚可更换一次试液。待材料能被轻压离散时，倾去碱液，用水洗至中性，即可取所需部位加稀甘油制片观察。用氢氧化钾溶液能逐渐除去细胞中的淀粉、蛋白质、油脂及色素，其作用较水合氯醛强，并能使细胞膨胀，若作用时间较长，能使纤维性组织解离，并可引起薄壁组织的破坏和变形。所以加热处理时间不宜太长。硝酸-铬酸离析法：适用于木质化组织，如木材、根、茎、树皮等材料，将材料放入坩埚或试管中，加10％硝酸与10％铬酸的等量混合液，其量为材料的20倍，放置浸渍的时间，视材料的性质而异，一般为1-2日或更长的时间。也可以采用加温的办法来缩短浸渍时间，以材料用玻璃棒轻压，可以离散为度，然后用水洗至中性，即可制片观察。硝酸和铬酸均为强氧化剂，解离速度较快，如解离柔软较嫩的材料，应注意掌握时间。经硝酸、铬酸解离的材料，草酸钙、碳酸钙结晶及淀粉粒、脂肪油等均已消失。氯酸钾法：本法适用于坚硬的材料，如木类及某些坚硬的果皮、种皮等，将材料置坩埚或小烧杯中，加50％硝酸试液约5ml及氯酸钾粉少量，缓缓加热至沸，当气泡渐少时，再及时加入少量的硫酸钾，以维持气泡稳定产生(约15～20分钟)，至材料能分离开时，倾去试液，加水洗涤数次，即可制片观察。采用此解离法制片需在通风处进行，以防氯气中毒。2．显微测微尺的使用显微测微尺是用来测量显微镜下所见物体长度、大小的标尺，包括载台测微尺和目镜测微尺。载台测微尺：为一特制的载玻片，在载玻片的中央封有lmm长的小尺，精确分成10大格，每大格又分10小格，共100小格，每小格长度为0.0lmm，即l0μm标尺的外围有一小黑环，便于在显微镜下寻找标尺。载台测微尺并不直接用来测量显微镜下物体的长度和大小，而是用以校正目镜测微尺的。经过校正之后的目镜测微尺，方可用来测量显微镜下物体的大小。目镜测微尺为一直径约20mm的圆形玻片，玻片的中央部分具有一小尺，精确地分成50小格或100小格(图2—2)。使用目镜测微尺时，将目镜自镜筒中抽出，旋开镜片，将目镜测微尺的标尺正面向上，安放在目镜中部的隔板上，旋上镜片，放回原镜筒内，进行测量。由于目镜测微尺每小格的长度随显微镜放大的倍数而改变，故在使用前必须将各物镜头逐一用载台测微尺加以校正，以便确定在使用此显微镜时各组镜头下目镜测微尺每小格所代表的实际长度。(1)目镜测微尺的校准：将载台测微尺放在显微镜的载物台上，于高倍镜下将测微尺清晰地调整到视野的中央，将目镜测微尺放人目镜内(有的已将目镜测微尺固定在目镜内)，适当移动载台测微尺，使二种尺子的刻度重合，找出二尺的重合刻度线，根据二条重合线问小格数的比值，计算目镜测微尺在高倍物镜下每小格的数值(μm)。如：目镜测微尺的77小格(0→77)与载台测微尺的30小格(0.7→1.0)相重合则目镜测微尺在高倍镜下每小格为10μm×30÷77=3.89／μm。一般需测试数次，取其平均值。如果接物镜和接目镜的放大倍数改变，目镜测微尺应重新校正。(2)细微物体的测量：将欲测量物体封于载玻片上，于显微镜下用已校正的目镜测微尺测量其长度或直径为目镜测微尺的几小格，然后乘以每小格的微米数即得。如：高倍镜下测得薄荷腺鳞直径为24小格，即为3．89μm×24=93μm。微细物体的测量，通常在高倍接物镜下测量，测定结果比较准确，但在测量较长的物体，如纤维、导管或非腺毛的长度时，则用低倍接物镜测量较好。3．描绘器的使用及描绘图放大倍数的计算描绘器是描绘显微镜下所见物体物像时所用的一种仪器，常见的有单独的描绘器和固定在目镜上的描绘器，描绘器(见图)由二个三棱镜A、B粘合在一起，A棱镜合面PP，除中央部的小圆孔M外，均涂以水银，旁侧有一反射棱镜C，与垂直方向约呈75°角，其底面FF＇上亦涂有水银。当载玻片上物体的物像经接物镜E、接目镜D及PP，平面上小孔M到达于眼时，同一双眼睛同时看到载物台的物体和图板上的铅笔、图纸，这样即可进行描绘。显微描绘器需配以绘图板。显微描绘器使用时取下显微镜的接目镜，装上描绘器，如不是附属在目镜上的描绘器尚需加上目镜，调节物像清晰后，再调绘图板的倾斜度，使与描绘器的角度相一致，用显微描绘器上的滤光片调节光线强弱，使视野中的物像及绘图纸上铅笔均较清晰，即可进行描绘。绘图时，先用HB型铅