基因克隆原理及实验介绍

基因克隆原理及实验介绍Theprincipleandexperimentofgenecloning中药教研室内容概要•实验进展汇报（5.10~8.24）•基因克隆基本原理及实验操作目的基因长度质粒载体备注结果NS1-11056bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功NS1-21056bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功NS1-31056bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功NS2A-1654bppcDNA3.1+3flag中间有2个位点突变成功NS2B-1390bppcDNA3.1+3flag不配对失败NS2B-2390bppcDNA3.1+3flag双峰失败NS2B-3390bppcDNA3.1+3flag中间有1个位点突变成功NS3-11854bppcDNA3.1+3flag测序有问题，需要沟通NS3-21854bppcDNA3.1+3flag测序有问题，需要沟通NS3-31854bppcDNA3.1+3flag测序有问题，需要沟通NS4A-1859bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，直接pcr成功NS4A-2859bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，直接pcr成功NS4A-3859bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，直接pcr成功NS4B-1336bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，重新实验失败NS4B-2336bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，重新实验失败NS4B-3336bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，重新实验失败NS5-12700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出来失败NS5-22700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出来失败NS5-32700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出来失败E-31485bppcDNA3.1+3flag中间有4个位点突变成功Cap-1339bppcDNA3.1+3flag前后有数个位点突变成功Cap-2339bppcDNA3.1+3flag前后有数个位点突变成功Cap-3339bppcDNA3.1+3flag前后有数个位点突变成功prM-1498bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功prM-2498bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功prM-3498bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功M-1225bppcDNA3.1+3flag中间有1个位点突变成功M-2225bppcDNA3.1+3flag没有突变成功M-3225bppcDNA3.1+3flag没有突变成功目的基因长度质粒载体备注结果NS3-11854bppcDNA3.1+3flag有2个突变成功NS3-21854bppcDNA3.1+3flag有2个突变成功NS3-31854bppcDNA3.1+3flag有2个突变成功NS4A-1381bppcDNA3.1+3flag没有突变成功NS4A-2381bppcDNA3.1+3flag没有突变成功NS4A-3381bppcDNA3.1+3flag没有突变成功NS4B-1744bppcDNA3.1+3flag有2个突变失败NS4B-2744bppcDNA3.1+3flag有3个突变失败NS4B-3744bppcDNA3.1+3flag有2个突变失败NS4A+2K-1450bppcDNA3.1+3flagNS4A+2K-2450bppcDNA3.1+3flagNS4A+2K-3450bppcDNA3.1+3flagNS5-32700bppcDNA3.1+3flagE1485bppcDNA3.1+3flagPCR做不出来失败prM-1498bppLenti+3flag无信号，取消测序失败prM-2498bppLenti+3flag没有突变成功prM-3498bppLenti+3flag没有突变成功M-1225bppLenti+3flagM-2225bppLenti+3flagM-3225bppLenti+3flag分子生物学DNARNA蛋白质转录翻译逆转录分子生物学是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学，其研究对象是核酸（DNA、RNA）和蛋白质等生物大分子，其研究内容包括核酸和蛋白质等的结构、功能及其遗传信息和代谢信息传递中的作用和作用规律。基因克隆•基因克隆（genecloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。•目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。pcDNA3.1+3flagpCR双酶切连接引物设计回收纯化重组质粒pcDNA3.1+3flag-NS3pCR双酶切连接转化挑菌提质粒测序大肠杆菌(感受态)引物设计回收纯化载体目的片段酶切鉴定网上检索引物设计DNA制备PCR扩增扩增产物纯化与克隆载体连接感受态E.coli制备转化、培养重组克隆筛选PCR或酶切鉴定测序生物信息学分析等质粒提取实验流程引物设计•从GenBank下载全基因组序列（completegenome），记录编号保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）•获取载体质粒的相关信息（抗性、标签、酶切位点）•复制到PrimerPremier5分析其酶切位点，选择共有的酶切位点•在目的基因合适的位置添加引物，并在引物前/后加上酶切位点pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计ori是复制起点,他被宿主细胞识别后才能在该细胞中复制。PrimerPremier5pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计PrimerPremier5pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计引物处理Procedure•标记，Sense→F，Antise→R，如“NS3SenseBamH1”，记为“NS3-F-BamH1”•离心，使粉末在底部集聚，12000g，10min（注意是g，不是rpm）•稀释，ddH2O按报告单储存浓度（100μM）的10倍量稀释至使用浓度10μM•保存，分装-20℃pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计Attention•离心时待离心机达到最高转速方可离开，防止不平衡造成损坏•μM是浓度单位，如100μM=100μmol/L•引物稀释量向上取5倍整数，如383μl稀释至385μlpCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计1预变性94℃2min2c变性98℃10s3c退火X℃30s*4c延伸68℃需计算*5总延伸68℃10min6冷却16℃10min总循环数30-40（from2cto4c）引物设计双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化pCR成分体积（μl）灭菌ddH2O3310×KOD-plus-neoBuffer5dNTPs（2mM）5MgSO43Template1PrimerR（10μM）1PrimerF（10μM）1KOD-plus-neoPolymease1Total50AB*延伸时间计算：，向上取整数（多预留延伸时间）)s30/bp1000(值)bp引物片段大小(扩增速度*退火温度计算：一般为上下游引物TM平均值—5℃Attention•试剂如不完全融化，会造成浓度不均，酶需冰上放置•PCR管根据目的基因名称、日期、编号做标记•模板(Template)可根据浓度确定加入体积，缓冲液(Buffer)必须在酶之前加入。•注意不同引物对应不同PCR管•PCR结果优化略，详见《pCR常见问题解决方法》引物设计回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序pCR琼脂糖凝胶电泳•琼脂糖凝胶具有网络结构，本身不带电荷。具有分子筛效应(凝胶色谱)与电泳效应。•目的：分离不同大小的核酸，以达到纯化、鉴定的目的。•原理：DNA分子迁移率与其大小成反比，电泳时根据分子大小不同形成不同的条带•根据目的基因片段大小，配制不同浓度的凝胶引物设计pCR双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化凝胶浓度目的基因片段(bp)0.5%1000-300000.7%800-120001.0%500-100001.2%400-70001.5%200-30002.0%50-2000引物设计pCR双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化Attention•琼脂糖凝胶可根据情况分成数小块（一般是每8孔），或插入孔径不同的梳子•EB具有强致癌性，应在污染区操作•为保持凝胶成像仪与点样顺序一致，点样时应从右往左点（靠近自己一段开始）•Marker是已知大小的正对照DNA，电泳能分离出不同条带，相当于尺子上的刻度，可以用来测算未知DNA样品的大小。•红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负)。引物设计pCR双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpEECapCapCapCap2B2B2A2ANS1NS1引物设计pCR双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化Procedure•打开紫外灯，在操作台上根据荧光位置切胶，动作要快并尽可能切小块，切出的凝胶转移至1.5mlEp管里，称量凝胶重量*凝胶成像仪的紫外灯对DNA有突变作用，应尽可能减少紫外灯对凝胶的照射•按照E.Z.N.ATMGelExtractionKit(200)试剂盒说明书回收纯化DNA：Objective•原理：限制性内切酶能特异地结合于一段特定的DNA序列的特异位点上,并切割双链DNA•目的DNA与质粒载体同时进行双酶切（两个不同的酶切位点，如BamH1和EcoR1），形成同样的酶切位点为进行连接引物设计pCR回收纯化连接转化挑菌提质粒测序双酶切Procedure目的DNA酶切体系试剂用量目的DNA41μlBuffer（10×）5μlenzyme12μlenzyme22μlddH2O补至50μl载体酶切体系试剂用量Plasmid4μg(Xμl*)Buffer（10×）5μlenzyme12μlenzyme22μlddH2O补至50μl*根据质粒浓度（如pcDNA3.1+3flag浓度为455ng/μl，4000bp，反应体积约为9μl）•混匀，37℃孵育4-6h（6h以上更佳）Objective•通过凝胶电泳验证目的DNA、质粒是否酶切成功，并通过胶回收DNA及质粒（切去的片段除外）最终回收体积为30μl•通过连接使目的DNA导入质粒中，为下一步转染准备引物设计pCR回收纯化双酶切转化挑菌提质粒测序连接Procedure目的DNA与质粒连接体系试剂用量目的DNA13-15μlplasmid2-4μl10×LigaseBuffer2μlT4DNALigase1μlTotal20μl•混匀，4℃过夜或常温条件下反应4h引物设计pCR回收纯化双酶切连接挑菌提质粒测序转化Objective•将连接产物通过转化转入到感受态大肠杆菌中，从而使连接产物（重组质粒）在大肠杆菌中大量复制LB培养基配制胰蛋白胨（Tryptone）10g/L酵母提取物（Yeastextract）5g/L氯化钠（NaCl）10g/L琼脂粉（Agar）*10-15g/L*配制固体LB时加入每锥形瓶加入200/250ml（定量）引物设计pCR回收纯化双酶切连接转化提质粒测序挑菌Objective•从大肠杆菌培养基中挑取优势菌落（单菌落）进行扩大培养•培养过夜后取出部分菌液进行保菌Procedure•消毒实验台及器具，取酒精棉球擦拭桌面、镊子，准备无菌枪头、试管、试管板两个，点燃酒精灯，酒精消毒双手•取LB培养液加入抗生素，向各试管中倒入LB培养液约10-15ml•从培养箱中取出培养皿，在火源附近打开，用镊子夹取一个枪头，挑取一个单菌落，轻轻沾取菌落，枪头丢入试管内，每菌种挑取2-3管•培养皿用封口膜封好放入4℃保存•将试管放入摇床震荡培养过夜，次日出现浑浊•消毒桌面，取1.5ml无菌Ep管标记•摇匀试管，使底