HIV抗体检测解读

HIV抗体检测HIV简介•HIV是HIV感染及艾滋病（AIDS）的病原体，主要通过性接触和体液传播，HIV主要侵犯和破坏辅助性T淋巴细胞（CD4+T淋巴细胞），使机体细胞免疫功能受损，最后并发各种严重的机会性感染和肿瘤。•HIV可分为HIV-1和HIV-2两个型，均为单链RNA病毒。前者分布广泛，后者主要局限于非洲某些国家和地区。HIV简介•人体感染HIV后，血液中最先出现HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出现。几周后出现IgM抗体并很快消失，此后IgG抗体出现并一直存在。HIV感染的实验室诊断以抗体检测为主，病毒及相关抗原的检测为辅，后者要求高，仅限于某些研究实验室中进行。HIV简介•HIV-抗体检测分为筛查试验和确认试验两种，筛查试验为阳性的血清必须进一步确认，确认为阳性的方可报告HIV感染阳性。•筛查试验的要求是敏感性高，理论上要求达到100%（97%--99%），尽可能避免漏掉可能阳性的对象，相对来说，对特异性（99%）要求不是太高，允许有少量假阳性，这些假阳性可以通过重复检测和确认试验排除。HIV抗体检测适用范围•适用于各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、检验检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对HIV感染者/AIDS病人的诊断、报告和处理的实验室依据。HIV抗体检测实验室•应符合《全国艾滋病检测工作规范（1997年版）》中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。•应符合《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004）对II级生物安全实验室（BSL-2）的各项要求。•实验室的质量保证和实验室安全防护按《全国艾滋病检测技术规范》规定执行。HIV抗体检测的目的•HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。•以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。•以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。•以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。HIV抗体检测的要点•筛查试验阳性不能出阳性报告。•严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。•严格按照试剂盒说明书操作。•注意防止样品间交叉污染。常规HIV抗体检测的方法•HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确认试验。•HIV抗体检测筛查试验•筛查试剂：必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。•筛查方法：常用的筛查方法是酶联免疫试验（ELISA）。目前国内外主要使用第三代（双抗原夹心法）试剂，第四代ELISAHIV抗原抗体联合测定试剂已在有些国家和地区用于血源筛查，同时检测抗原抗体，可将检出时间提前4~9.1d，有利于降低血源筛查的残余危险度。其他简便快速的HIV检测方法•明胶颗粒凝集试验（PA）：PA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFDHIV-1/2PA），已经我国食品药品监督管理局（SFDA）注册批准。•斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）：以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10min以内，使用抗原量少。其他简便快速的HIV检测方法•斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验：与斑点EIA相似，也是以硝酸纤维膜为载体。区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品。一般可在1030min内判读结果。其他简便快速的HIV检测方法•艾滋病唾液检测卡：在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIVIgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免静脉穿刺。几种常规HIV抗体检测方法的比较第三代ELISA第四代ELISAPA胶体硒WB检测的是总抗体，第四代ELISA可同时检测P24抗原主要包括IgM、IgG抗体IgG抗体P24抗原消失、抗体产生时敏感性高感染早期P24抗原出现时敏感性高操作方便易行，敏感性特异性均可敏感性低于第三代、第四代ELISA和PAIgG抗体出现时特异性高几种常规HIV抗体检测方法的比较•在感染早期，IgM抗体出现时第三代、第四代ELISA、PA、胶体硒方法优于WB，而在方法学上，硒标的敏感性要低于第三代、第四代ELISA和PA。•因此，当两种筛查试验均阳性或一阴一阳而WB阴性时，不能轻易报告阴性，要同WB不确定反应一样，至少随访6个月，以防漏检。建议将WB和胶体硒法检测的“窗口期”至少定为6个月。样品初筛检测筛查试剂阳性反应阴性反应重复检测原有试剂加另外一种筛查试剂一阴一阳均阴性反应均阳性反应送确认实验室确认报告阴性HIV抗体筛查检测流程HIV抗体初筛试验•实验准备：将试剂和样品放置在室温(20℃)平衡,按实验室SOP做好试剂准备。•实验操作：按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。•实验结果：NC、PC符合试剂盒实验成立的条件，Cutoff值=阴性对照均值+C，小于Cutoff为阴性，大于或等于Cutoff为阳性。•报告：对呈阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具HIV抗体阴性报告；对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。HIV抗体复检试验•对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认（蛋白印迹试验）。•对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告；对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告。•初筛试验呈阳性反应样品转送时需填写“HIV抗体复测送检单”。•对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。HIV抗体确认试验结果报告•HIV抗体阴性：无HIV抗体特异带出现。•排除因“窗口期”而出现的假阴性结果，建议高危行为后3个月时再做抗体检测。也可进行HIV-1P24抗原或HIV核酸检测，作为辅助诊断。•HIV抗体不确定（±）：出现HIV抗体特异带，但不足以判定阳性，在备注中应注明“3个月后复检”。•随访复检：每3个月随访复检1次，连续2次，共6个月。如果检测时暴露时间已超过3个月，则在3个月后随访1次即可。•必要时可做HIV-1P24抗原或HIV核酸测定，但检测结果只能作为辅助诊断依据，确认报告要依据血清学随访结果。HIV阳性结果的判定•HIV-1抗体阳性（+）：至少有2条env带（gp41和gp160/gp120）出现,或至少1条env带和p24带同时出现。•HIV-2抗体血清学阳性（+）：同时符合试剂盒提供的阳性判定标准和WHO阳性判定标准，即出现至少2条env带(gp36和gp140/gp105)。WB确认试验中HIV抗体特异带•HIV-1抗体特异带：•env带:gp160/gp120、gp41；•gag带:p55、p24、p17(或p18)；•pol带:p66(或p65)、p51、p31。•HIV-2抗体特异带：•env带:gp140/gp105、gp36（也可为gp125/gp80、gp36）；•gag带:p56、p26、p16；•pol带:p68、p53、p34。目的地区人群替代策略艾滋病疫情报告任何地区任何人群替代策略Ⅰ高流行地区高危人群替代策略Ⅱ高流行地区一般人群替代策略ⅢVCT其它地区任何人群替代策略ⅢHIV抗体检测的替代策略送检样品用两种不同原理或不同厂家的试剂复测（其中包括进口第三代ELISA试剂进口第三代ELISA试剂复测S/CO比值≥6.0进口第三代ELISA试剂复测S/CO比值1.0－5.9确认试验判定阳性，上报疫情两种均阳性两种均阴性一阴一阳阳性反应阴性反应选用筛查试剂阳性阴性不确定，随访判定阴性替代策略Ⅰ（HIV感染疫情报告检测策略）检测流程阳性不确定样品ELISA-1阳性两种均阳性确认试验阴性二种S/CO均≥6一种或二种S/CO1~5.9阳性阴性或可疑高特异性筛查试剂提供阳性咨询出具“HIV抗体阳性”报告提供咨询随访阴性提供阴性咨询出具“HIV抗体阴性”报告ELISA-1+ELISA-2一阴一阳两种均阴性替代策略Ⅱ（高危人群VCT检测策略）检测流程阴性阳性样品筛查试剂1（高敏感性）阳性阴性提供阳性咨询出具“HIV抗体阳性”报告提供咨询随访提供阴性咨询出具“HIV抗体阴性”报告筛查试剂2（高特异性）筛查试剂3（高特异性）阳性阴性提供疑似阳性咨询建议进一步做确认试验阳性不确定阴性替代策略Ⅲ（一般人群VCT策略）的检测及结果报告流程图HIV抗体检测情况季报流程艾滋病筛查中心实验室艾滋病确认中心实验室省卫生行政部门同级卫生行政部门未设置艾滋病筛查中心实验室的地区艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点每季首月5日前报告上季检测情况每季首月10日前报告上季检测情况每季首月5日前报告上季检测情况艾滋病确认实验室每季首月15日前报告上季检测情况每季首月10日前报告上季检测情况中国CDC性艾中心艾滋病参比实验室HIV核酸定性检测•规定了核酸检测、核酸序列测定的实验室条件、检测方法及结果判定标准•结果报告：HIV核酸检测阴性:只可报告本次实验结果阴性。HIV核酸检测阳性:可作为诊断HIV感染的辅助指标，不单独用于HIV感染的诊断。•严格的实验室管理制度（分区、仪器和材料的专用、单向流向、废弃物处理）HIVRNA定量测定（病毒载量测定）•实验室条件实验室功能分区（试剂准备区、样品处理区、扩增区和扩增产物分析区）人员(具有艾滋病实验室上岗资格并接受省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训)设施和设备（区域性专用）•方法常用的HIVRNA定量测定方法有逆转录PCR试验（RT-PCR）、核酸序列扩增试验（NASBA）、分支DNA杂交试验（bDNA）。RocheBayerbioMerieux商品名AmplicorVersantNucliSens技术原理RT-PCRbDNANASBA结果比较RT-PCR试验的结果近似于2.0或3.0版bDNA试验的结果bDNA2.0版或3.0版的试验结果与RocheRT-PCR实验的结果具有可比性结果与RT-PCR和bDNA具有可比性，但支持性资料少于前者优点/缺点与Bayer的方法相比假阳性较少。已获FDA批准。需要时间较短。动态范围广。已获FDA批准。能够使用组织或体液样品，例如阴道分泌物。动态范围最大。已获FDA批准。动态范围标准：（1.5版）400-750,000c/ml超敏：（1.5版）50-75,000c/mlbDNA3.0版：75-500,000c/mlNuclisensHIV-1QT：176-3,500,000c/ml取决于标本量扩增的亚型1.0版：只有B亚型1.5版：B-GA-HA-G标本量Amplicor-0.2ml超敏-0.5ml1ml10μl-2ml抗凝剂EDTAEDTAEDTA、肝素、全血、任何体液、PBMC、精液、组织等要求6小时之内分离血浆，运输前在-20℃或-70℃冷冻。4小时之内分离血浆，运输前在-20℃或-70℃冷冻。4小时之内分离血清或血浆，运输前在-20℃或-70℃冷冻不同病毒载量检测方法的比较HIV核酸定量检测的意义•辅助诊断：当RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果时（3，000c/ml），