代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)高通量药物筛选模型的建

生物工程学报ChinJBiotech2009,March25;25(3):457-4[e-mail]©2009InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,AllrightsreservedReceived:October24,2008;Accepted:December30,2008Correspondingauthor:YalingZhang.Tel:[phone];E-mail:[e-mail]生物技术与方法代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)高通量药物筛选模型的建立张娅玲1,2,白艳秋1,21中国科学院北京基因组研究所,北京1013002中国科学院研究生院,北京100039摘要:为发现代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)的调节剂,通过荧光检测胞内钙浓度的方法,建立一个基于细胞功能性检测的高通量筛选(HTS)系统。将人mGluR4基因转染稳定表达G15蛋白的人胚肾细胞(HEK-293),用Zeocin筛选获得稳定表达mGluR4的细胞株,并通过钙流检测试验证实该细胞系的生物学功能。优化了实验系统中荧光染料的孵育时间,溶剂二甲基亚砜(DMSO)耐受性,以及溶剂氢氧化钠(NaOH)耐受性,建立了可靠稳定的筛选系统。钙流检测试验数据表明,mGluR4细胞系对其激动剂的活性程度排序是:L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyricacid(L-AP4)L-Serine-O-phosphate(L-SOP)L-Glutamicacid(L-Glu);拮抗剂是:(RS)--Methylserine-O-phosphate(MSOP)(RS)--Methyl-4-phosphonophenylglycine(MPPG)。在96和384细胞微孔培养板中,得到该筛选系统Z’因子分别是0.80和0.65。结果表明,该稳定细胞系拥有一个稳定的检测系统,适合于mGluR4激动剂/拮抗剂的筛选。关键词:代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4),高通量筛选(HTS),G15,激动剂/拮抗剂Developmentofafunctionalcell-basedHTSassayfortheidentificationmGluR4modulatorsYalingZhang1,2,andYanqiuBai1,21BeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciences,Beijing101300,China2GraduateUniversityoftheChineseAcademyofSciences,Beijing100039,ChinaAbstract:Toidentifymetabotropicglutamatereceptor4(mGluR4)modulatorsbyCa2+influxassay,wedevelopedthefunctionalcell-basedhighthroughput-screening(HTS)assay.ThehumanmGluR4cDNAwastransfectedintoHEK-293stablyexpressingpromiscuousG-protein(G15)cells.RecombinantstablemGluR4celllinewasselectedunderZeocinandvalidatedbyCa2+influxassay.TheassaywasoptimizedonloadingtimeofFluoCalciumIndicator,Dimethylsulfoxide(DMSO)toleranceandsodiumhydroxide(NaOH)toleranceusingagonist(L-Glutamicacid(L-Glu))ofmGluR4.TherankorderoftheagonistpotencyforthestablehumanmGluR4celllinewasL-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyricacid(L-AP4)L-Serine-O-phosphate(L-SOP)L-Glu,andoftheantagonistpotencywas(RS)--Methylserine-O-phosphate(MSOP)(RS)--Methyl-4-phosphonophenylglycine(MPPG).Z’factorvalueofthecelllinein96-and384-wellplateformatwas0.80and0.65.OurdataindicateasuccessfuldevelopmentoffunctionalhumanmGluR4recombinantstablecelllinethatwassuitableforhighthroughputscreeningtoidentifymGluR4agonist/antagonist.458ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechMarch25,2009Vol.25No.3Journals.im.ac.cnKeywords:metabotropicglutamatereceptor4(mGluR4),highthroughputscreening(HTS),G15,agonist/antagonist谷氨酸是公认的最重要的兴奋性神经递质之一,其在众多的中枢神经功能方面发挥着重要的作用,例如:记忆的获取与学习,癫痫、中风等功能紊乱,神经退行性疾病等[1]。L-谷氨酸通过与谷氨酸受体相结合发挥其生理作用[2,3]。谷氨酸受体分为2类:离子型谷氨酸受体(Ionotropicreceptors)和代谢型谷氨酸受体(Metabotropicreceptors)。离子型谷氨酸受体(iGluRs)包括3个亚型:IV_甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)、红藻氨酸(Kainicacid)和使君子氨酸受体(-amino-3-hydroxy-5·methyl-4.isoxazolepropionate,AMPA),该类受体被激活后能促使离子通道开放,从而阳离子如Na+、Ca2+等进入细胞内;代谢型谷氨酸受体(mGluRs)包括mGluR1-8共8个受体亚型,为G蛋白偶联受体家族成员[4],有7个跨膜结构,通过介导第二信使来调节受体生理功能[5]。根据代谢型谷氨酸受体氨基酸系列同源性、信号转导机制和药理学特性,将其分为3组:第1组包括mGluR1和mGluR5,能被3,5-DHPG选择性的激活,它们被激活后,使PLC活化,促使PI水解产生IP3和DAG,增强iGluRs异常介导的神经兴奋毒性;第2组包括mGluR2和mGluR3,其在重组系统中负调控腺苷酸环化酶(AC),LY379268是其选择性的激动剂;第3组由mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8组成,其同样是负调控AC,可以被L-AP4激活[4,5]。这些受体被激活后,可以调节谷氨酸神经递质的传递。神经递质传递的异常将会引起众多的疾病。因此,这些受体已经成为药物研发的重要靶点,开发与此类受体特异性作用的药物刻不容缓,而建立快速、方便、经济的筛选平台可以大大加快此类新药的筛选与开发。代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)集中分布于小脑颗粒细胞中,在嗅觉组织中也发现mGluR4特异性的表达[5]。发现并开发mGluR4特异性的调节剂,可以促进众多的与其相关的疾病治疗。大规模的药物开发必不可少的要应用高通量筛选(Highthroughputscreening,HTS)平台,这样不仅可以节省人力、物力,又可以大大缩短药物研发前期所消耗的时间。先前的研究报道已有基于细胞水平的功能性检测方法用于筛选mGluR4调节剂[610],例如:GomezaJ等用鼠mGluR4基因和G-蛋白(G15、G16、Gq/I)瞬时共转染人胚肾细胞(HEK-293)后用于mGluR4的研究[10];KowalD等用人mGluR4基因和Gqi稳定共转染仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)并用于mGluR4的相关研究[7]。在本研究中,用人mGluR4重组质粒(HumanmGluR4-pcDNA4/TO)转染稳定表达G15的HEK-293细胞株,通过抗生素的筛选得到重组细胞株,并应用钙流检测试验进行进一步的确定及试验条件的优化。结果表明,一个基于重组细胞水平的功能性检测、适用于鉴定mGluR4激动剂/拮抗剂的HTS平台被成功建立。1材料和方法1.1试剂和仪器稳定表达G15的人胚肾细胞(HEK-293/G15)由本实验室保存;DMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMediumpowder,highglucose,GibcoBRL);Glutamine-freeDMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMedium,highglucose,1X,-L-Glutamine,Gibco);FBS(FetalBovineSerum,Hyclone);dFBS(DialyzedFetalBovineSerum,Hyclone);选择性抗生素Zeocin(Invitrogen);Trypsin(Invitrogen);MatriGel®Matrix(BDBioscience);转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen);荧光染料Fluo-3/AM(MolecularProbes);Probenecid(Sigma);L-Glutamicacid(L-Glu,Sigma);L-AP4(L-(+)-2-Amino-4-phosphonobutyricacid),L-SOP(L-Serine-O-phosphate),MPPG((RS)--Methyl-4-phosphonophenylglycine)和MSOP((RS)--张娅玲等:代谢型谷氨酸受体4亚型(mGluR4)高通量药物筛选模型的建立459Journals.im.ac.cnMethylserine-O-phosphate)从Tocris购买。1.2质粒构建通过基因合成获得人源mGluR4的cDNA,并且通过NotI+XbaI亚克隆到真核生物表达载体pcDNA4/To上。所得到的表达质粒命名为mGluR4-pcDNA4/To.1.3稳定表达mGluR4细胞系构建稳定表达G15蛋白的人胚肾细胞(HEK-293/G15)培养在含有10%FBS的DMEM培养基中,置于37oC,5%CO2温箱中培养。将HEK-293/G15接种于6孔细胞培养板中,待细胞生长到50%~70%汇合率时用于转染。使用LipofectamineTM2000将人源mGluR4-pcDNA4/TO质粒转染HEK-293/G15细胞(转染操作参照试剂盒说明书进行),HEK-293/G15细胞作为阴性对照。转染24h之后,将细胞以1:5和1:10的比例传代于100mm培养皿中。细胞贴壁生长24h之后,加入120g/mLZeocin进行抗生素筛选。每3d换一次加有120g/mLZeocin的新鲜培养基,连续筛选2周。当阴性对照细胞(没有转染的HEK-293/G15)在抗生素作用下完全死亡之后,挑选单细胞克隆团于96孔细胞培养板中(Corningcostar)进行扩大培养。根据激动剂作用于细胞后引起胞内钙流变化的原理进行阳性细胞克隆的选择。选择具有明显钙流信号变化的细胞克隆(设定为P0代)传代培养,并进行进一步的功能验证。当细胞生长到90%汇合率的时候即进行传代培养,以1:8到1:10的比例传代培养于含有5mL新鲜培养基(加有60g/mLZeoc