微生物实验―细菌的染色技术及大小的测定

实验三细菌的染色技术及微生物大小的测定第一部分细菌的染色技术•目的要求•染色剂和染色的原理•实验材料•实验程序目的要求•掌握微生物的染色原理•掌握染色的基本操作技术•掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法染色剂和染色原理Ⅰ•微生物染色的基本原理：细菌机体无色透明，与背景反差小，可将细菌染色，增加其反差；细菌在通常培养状态下总带负电荷，故可用带正电荷的碱性染料染色。•染色剂染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：•1.酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。•2.碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。•3.中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。•4.单纯染料：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类的染料。染色剂和染色原理Ⅱ微生物染色常用染料如下表：实验材料•显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯。•石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液•菌种：枯草杆菌、大肠杆菌实验程序Ⅰ（细菌染色的方法和步骤）•细菌染色的方法:•1.简单染色法：用一种染色液染菌体后，就可以观察微生物的大小、形状和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。•2.复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法、细胞染色法等。•染色技术的一般过程涂片干燥固定染色媒染脱色复染水洗干燥镜检实验程序Ⅱ（简单染色的方法和步骤）•简单染色法(一般染色法)•1.涂片•2.干燥：自然晾干或酒精灯高处微微加热。•3.固定•4.染色：在整个涂面上滴加染色液，染色１min。•5.水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。•6.吸干•7.镜检实验程序Ⅲ（革兰氏染色的方法和步骤）•革兰氏（Gram）染色法1.涂片、干燥、固定2.初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：加革氏碘液媒染1min，水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30s～45s，接着立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液染1min，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：观察染色结果并绘图。第二部分细菌大小的测定目的要求•学习使用目测微尺和物测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法。•测定的工具：目测微尺和物测微尺•目测微尺是一圆形玻片，其中央刻有5mm长、等分为50格的标尺，每格的长度随使用目镜和物镜的放大倍数及镜筒长度而定。使用前用物镜测微尺标定，用时放在目镜内。•物测微尺是一厚玻片，中央有一圆形盖玻片，中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，每格为10μm用以标定目测微尺在不同放大倍数下每格的实际长度。目测微尺的标定：•将目测微尺装入目镜的隔板上，刻度朝下；把物测微尺放在载物台上，刻度朝上。•用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条刻度线重合，顺着刻度找出第二条完全重合的刻度线。•计算两刻度间目测微尺的格数和物测微尺的格数。•由于物测微尺的刻度每格长10µm，得×(m)10物测微尺格数目测微尺每格长度＝目测微尺格数菌体大小的测定•取下物测微尺，将细菌染色标本置于载物台上，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的长和宽。注意：校正目测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这特定的情况下才可重复使用。实验三结束实验安排实验内容034060310340603203406033显微镜的使用及微生物形态观察16周，周二5～6节16周，周三晚上16周，周五晚上细菌培养基的制备、灭菌及接种、培养技术17周，周二5～8节17周，周三晚上17周，周五晚上细菌的染色技术及微生物大小的测定18周，周二5～8节18周，周三晚上18周，周五晚上