徐涛香菇多糖

香菇多糖的生产工艺精化1121徐涛主要内容•认识产品•追根求源•生产技术一认识产品1结构式2性质物理：白色或棕黄色粉末状固体化学：能溶于0.5MNaOH溶液中，溶解度可达50-100mg/ml；不溶于甲醇、正丁醇、高浓度乙醇、丙酮等有机溶剂。生物：抗肿瘤，抗病毒3产品的功能免疫调节功能抗肿瘤抗感染保肝作用抗氧化、延缓衰老抗突变作用抗病毒作用•保健品广西桂林实力天然食品有限公司生产的荷仕威香菇多糖颗粒冲剂有免疫调节的功效•治疗各种感染香菇多糖注射液与抗生素合用,能有效防治反复呼吸道感染的发生。•药品配合其他药物治疗慢性乙肝,可提高乙肝病毒标志物的转阴作用•农药香菇多糖0.5%水剂对番茄病毒病、烟草病毒病有较好的抗病毒作用4产品的应用5产品的质量标准正式名：香菇多糖汉语拼音：Xianggu标准号：WS-291（X-256）-97拉丁文或英文：Lentinan主要活性成分：香菇[Lentinusedodes（Berk）sing]子实体提取、精制的多糖。按干燥品计算，含香菇多糖应不得少于92.0%。性状：类白色或浅黄色粉末；无味，有引湿性。在水、甲醇、乙醇或丙酮中几乎不溶；在0.5mol/L氢氧化钠中溶解。比旋度取本品，置五氧化二磷干燥器中，减压干燥至恒重，精密称取适量，加0.5mol/L氢氧化钠溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定（中国药典），范围在+2～+15之间。鉴别：（1）取含量测定项下的溶液2ml，加蒽酮溶液（取蒽酮35mg置100ml量瓶中加硫酸溶解，并用硫酸稀释至刻度，即得，临用配制）5ml，振摇混匀，置水浴中加热，应显蓝绿色。（2）取本品约10mg，滴加水少许研磨，再加水制成每1ml中含0.5mg的溶液，置匀浆器中制成匀浆液，取10ml，加高碘酸钠溶液[取高碘酸钠（NaIO4）4.28g，加0.005mol/L硫酸溶液。溶解并稀释至1000ml]1ml，摇匀，立即取反应液4ml，以水为空白对照，照分光光度法（中国药典1995年版二部附录ⅣA），在295nm的波长处测定吸收度（A1），剩余的反应液置避光容器中。于3O℃连续搅拌6小时后，取出，测定吸收度（A2）。两次吸收度之差（A1-A2）应为0.15～0.25。（3）红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致，在89Ocm-1上附近有弱吸收峰。检查：酸碱度取本品，加水制成0.05%的匀浆液，依法测定（中国药典1995年版二部附录ⅥH），pH值应为6.0～8.0。特性粘数取本品，置五氧化二磷干燥器中，减压干燥至恒重，精密称取适量，加0.5mol/L氢氧化钠溶液数滴，使充分溶胀，研磨均匀，在25～30℃放置6～8小时，使完全溶解，制成每1ml中含0.5mg的溶液，摇匀，依法测定（中国药典1995年版二部附录ⅥG第三法），特性粘数应为60～130。干燥失重取本品适量，置五氧化二磷干燥器中，减压干燥至恒重，减失重量不得过3.5%（中国药典1995年版二部附录ⅧL）。含量测定：对照品溶液的制备取香菇多糖对照品25mg，精密称定，加0.5mol/L氢氧化钠溶液10ml，研磨，使溶解，加水分次转移至1000ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。供试品溶液的制备取本品25mg，精密称定，照对照品溶液的制备项下，自“加0.5mol/L氢氧化钠溶液……”起，依法制备，即得。测定法精密量取对照品溶液与供试品溶液各2.5ml，分别沿管壁缓缓加至已精密加入蒽酮溶液5ml的试管中，使分层（以上操作均在冰浴中进行），待剧烈振摇混匀后，立即置沸水浴中加热，自振摇起计时，准确反应6分钟，将试管移至冰浴中冷却后，放至室温。自振摇起，应在20～40分钟内，以水为空白，照分光光度法（中国药典1995年版二部附录Ⅳ）在625nm的波长处测定吸收度，计算，即得。蒽酮硫酸溶液的配制取蒽酮（分析纯）35mg置100ml量瓶中加硫酸溶解，并用硫酸稀释至刻度即得，临用配制。作用与用途：抗癌辅助用药。二追根求源1诞生与发展过程1968年日本千原吴郎首先利用热水从香菇子实体中浸提出6种胞外LNT51970年Chihard和Sasaki用热水浸提结合有机溶剂沉淀从香菇中提取到另外4种多糖。1986年获日本厚生省批准生产并外销。1988年我国卫生部批准进口，现今我国已有几家国产LNT上市(如南京振中和福州梅峰等)。香菇多糖由于是单一组分，质量易于控制，且具有疗效高，剂量低，毒副作用小等优点，受到医生的青睐。近年来，LNT的广泛药理作用研究取得了很大进展。•热水浸提法•酶解法•超声波提取法•微波提取法•深层发酵培养提取法2各种生产方法比较01.热水浸提法02.酶解法03.超声波提取法04.微波法提取香菇多糖05.深层发酵培养提取法06方法比较3现在常用的生产方法深层发酵培养提取法三生产技术1原料及要求1.1菌种鸡腿蘑(Corprinuscomatus)菌株Co一1由河南科技大学林学院园艺研究所提供。1．2主要试剂葡萄糖麦芽糖乳糖可溶性淀粉硝酸钾硫酸铵酵母膏蛋白胨磷酸二氢钾硫酸镁硫酸钙苯酚硫酸无水乙醇三氯甲烷(氯仿)正丁醇碳酸氢钠氢氧化钠DEAE-纤维素32SephadexG-200分析纯分析纯分析纯生化试剂分析纯分析纯生化试剂生化试剂分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯生化试剂生化试剂天津市科密欧化学试剂开发中心北京益利精细化学品有限公司天津市科密欧化学试剂开发中心天津市科密欧化学试剂开发中心西安化学试剂厂北京化工厂北京奥博星生物技术有限责任公司北京双旋微生物培养基制品厂天津石英钟厂霸州市化工分厂北京化工厂西安化学试剂采购站经销(秦岭化工厂)天津博迪化工有限公司开封东大化工(集团)有限公司试剂厂国药集团化学试剂有限公司国药集团化学试剂有限公司天津市化学试剂一厂北京化工厂上海试剂四厂昆山分厂市售北京欣经科生物技术公司斜面培养基(％)：马铃薯20，葡萄糖2，KH2P040．2，MgS040．05，琼脂2，VBxl0mg／L,，pH6．0液体种子培养基(％)：马铃薯20，葡萄糖2，KH2P040．2，MgS040．05，玉米浆0．5，pH6．0发酵基础培养基(％)：葡萄糖2，蛋白胨0．2，KH2P040．2，MgS040．1，玉米浆0．5，pH6．0发酵优化培养基(％)：玉米淀粉4，黄豆饼粉0．2，蔗糖3，KH2P040．1，MgS040．1，Cas04O．05，玉米浆0．5，pH6．01．3培养基2生产原理利用深层液体发酵培养香菇菌丝体后，从发酵液中提取菌丝体，从而得到胞内香菇菌丝体，再从菌丝体中，利用它在酒精和水，及酶液的不同溶解度来提取胞内多糖。将菌丝体抽提、浓缩、离心，取上清液脱色透析，透析液再浓缩、离心，最后用溶液沉淀、洗涤干燥而成。3工艺流程菌种斜面培养摇瓶扩大培养种子罐扩大培养原料预处理水解过滤淀粉水解糖配料发酵空气空气压缩机冷却气液分离过滤除菌4工艺流程说明及主要工艺参数菌种活化将保藏的鸡腿蘑菌种转接于斜面培养基上，25℃培养至满管。选择菌丝生长旺盛的菌种备用。斜面培养从已活化的斜面菌种中取出约O．5锄2大小的菌丝块，接种于空白斜面培养基中部，于25℃培养至满管。液体种子培养将斜面菌种切割成约0．5cm2大小的菌丝块，接种于装有lOOmL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，每瓶接半支斜面。于25-26C，140．150r／min振荡培养4d。摇瓶培养将液体种子按10％接种量接种于装有90mL液体培养基的250raL锥形瓶中，于25．26℃，140-150f／rain振荡培养5d。玉米淀粉、红薯淀粉的预处理当以玉米淀粉、红薯淀粉为培养基原料时，为了避免淀粉性多糖对试验结果的影响，在配制培养基时首先对玉米淀粉、红薯淀粉进行了预处理。处理方法如下：加水煮沸15rain左右，待其充分糊化后冷却至60℃，加0．1％a-淀粉酶保温至碘反应不显蓝色为止，四层纱布过滤，取其滤液备用。。温度对香菇深层发酵的影响发酵培养的温度是一项重要的发酵参数，它对许多方面产生影响。表观上讲，它可以影响食用菌的生长、繁殖、代谢等，并影响到发酵培养基的物理化学性质，如溶氧、pH值、氧化还原电位等；微观上由于它通过影响食用菌膜的液晶结构、酶和蛋白质的合成和活性、以及RNA的结构及转录等影响微生物生命活动，改变甚至破坏微生物的代谢调控机制，影响菌体的酶的合成方向，并直接影响到酶系的组成，从而影响代谢产物的形成。温度对食用菌菌丝的生长是双方面的：温度升高，可以加快菌体的生长，但是随着温度的上升，细胞中对温度敏感的组成物质可能会遭到破坏，而且温度过高，菌体易老化，影响到各种酶系的活性，从而影响菌体生长和胞外多糖的形成。装液量对香菇深层发酵的影响香菇是好气性真菌，足够的氧气是保证香菇正常生长发育的重要环境条件。当空气不流通，氧气不足时，呼吸作用受到阻碍，菌丝的生长繁殖和子实体发育就会受到抑制，甚至死亡。缺氧时，菌丝借酵解作用暂维持生命，但时间过长会消耗大量营养，使菌丝容易衰老或死亡。其生长繁殖及代谢产物的合成过程需要大量的能量，为了获得足够多的能量，以满足细胞生长和发酵代谢产物的需要，培养基中的能源必须经有氧降解才能产生大量的ATP。为此，必须供给充足的氧气。在发酵过程中，随着培养时间的延长，鸡腿蘑的生物量不断增长，到第7d达到最大值，达到1．92/100mL，然后缓慢下降。发酵液中的胞外多糖含量在发酵的前两天处于很低的水平，第3d开始迅速上升，到第6d达到最高值，达到1．469／L，然后缓慢下降。说明在发酵的第1d和第2d菌丝体基本未向发酵液中分泌胞外多糖，而第1d和第2d测到的糖含量(O．049／L)可能是玉米淀粉在用§．淀粉酶处理时未完全降解掉的少许寡糖。从第3d开始菌体大量向发酵液中分泌胞外多糖，到第6d达到最高值，之后由于营养物质变得不充足，菌体自身分泌出的胞外多糖可能又被自身利用，所以胞外多糖产量在后期开始下降。发酵液pH在整个发酵过程中变化不大，由初始的6．05下降到5．43，这可能与该菌株产生少量的酸性物质有关。因此，发酵周期达6d可结束发酵，以获得较高的菌丝量和胞外多糖含量，此时的胞外多糖含量可达1．469／L，生物量达到17．709／L。Sevag法脱蛋白在一定体积的粗多糖溶液中，加～定体积的Sevag试剂(氯仿，正丁醇按照一定的比例混合)。充分混匀后静止一定时间，放置于分液漏斗中，分层后弃去下层有机溶剂层及中间的蛋白质层。脱色活性炭为黑色细微粉末，无臭、无味。具有无毒，脱色、脱臭效果良好的特点，可以反复使用，成本低，适合工业化生产的需要。粉末活性炭具有惊人的比表面积(800--'2000m2／g)[62]，当被脱除的有色物质的分子直径小于或等于活性炭孔的入口直径时，可被活性炭吸附而起到脱色的效剽631。活性炭的脱色效率高、速度快、成本较低，但也存在一些问题，如再生困难、多肽和氨基酸损失率较高。吸附剂是酶解液脱色的主要影响因素，虽然从液体中脱除颗粒活性炭比粉术活性炭容易得多，但考虑到精制的需要，选择粉末活性炭并优化其脱色工艺。透析脱盐将去蛋白后的多糖提取液装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中透析48h,并及时换水。浓缩将经过透析脱盐后的多糖提取液，利用旋转蒸发仪在60C下减压浓缩至原体积的1/3。DEAE．纤维素32的处理DEAE一纤维素32(再生)一0．5mol／LNaOH和0．5moYLNaa混合溶液处理0．5h一蒸馏水洗至中性一0．5mol／LHCl溶液处理O．5h一蒸馏水洗至中性一0．5mol／LNaOH溶液处理0．5h一蒸馏水洗至中性一0．5mol／LHCI溶液处理0．5h一蒸馏水洗至中性一悬浮于蒸馏水中备用。SephadexG-200凝胶的处理SephadexG一200凝胶一5．10倍的蒸馏水充分浸泡一倾斜法除去表面悬浮的小颗粒一0．5mol／LNaOH和0．5mol／LNaCI混合溶液在室温下浸泡O．5h一蒸馏水洗至中性一煮沸法除去气泡一冷却后备用。冷冻干燥将透析好的样液倒入冷冻干燥瓶，置于冰箱的速冻室中使之全部冻结后，放入冻干机中进行冷冻干燥。冷冻干燥的温度为