关于生物制药技术

第二章关于生物制药技术第一节生物技术在制药工业中的应用第二节生物制药技术概论第三节基因工程技术第四节原生质体融合技术第一节生物技术在制药工业中的应用•一：酶蛋白抑制剂二：基因工程药物三：动物细胞基因在植物中的表达四：基因重组疫苗五：基因治疗药物•现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程四大类。•基因工程药物又涉及到酶蛋白抑制剂、基因重组疫苗、单克隆抗体、基因治疗药物。一：酶蛋白抑制剂•不同的酶抑制剂可用于治疗许多不同的疾病。（1）蛋白酶抑制剂可治疗肿瘤、气肿病。（2）角鲨烯合成酶抑制剂可降低胆固醇。（3）3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A胆固醇乙酰转移（4）酶抑制剂治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化。（5）血管紧张素转化酶抑制剂可治疗高血压。（6）糖苷水解酶抑制剂可治疗糖尿病、高脂蛋白血症、肥胖症。（7）磷酯酶抑制剂可治疗胰腺炎。二：基因工程药物•基因工程药物着眼于整个基因组，其方法是让目的基因在一个体外系统的细胞中表达，再经过分离纯化，来生产药物。基因工程有以下分类：1：细菌基因工程2：哺乳动物细胞工程3：哺乳动物体内生物反应器工程4：哺乳动物乳腺反应器工程1：细菌基因工程•把目的基因导入到细菌中，通过目的基因所表达的蛋白质，来生产药物。•细菌基因工程的缺点：（1）由于细菌是低等生物，有时不能转录和翻译所导入的基因，或者所表达的蛋白质缺乏生物活性。（2）细菌工程药物的生产需要一个很大的发酵车间，其生产成本较高。2：哺乳动物细胞工程•通过培养动物细胞，将目的基因导入到动物细胞内，用来生产动物或人所需要的蛋白质药物。例如：人凝血因子1X就是通过动物细胞工程生产的。•优点：药物对于人体来说具有较大的组织相容性。•缺点：（1）动物细胞培养条件十分苛刻。（2）生产成本较高转基因动物1974年，Jaenish和Mintz应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了AV40DNA转基因小鼠。Palmiter等人于1982年将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中。3：哺乳动物体内生物反应器工程•这种方法实际上就是转基因动物生产技术的应用，将目的基因导入到动物的受精卵中，与染色体DNA整合，从而形成稳定的遗传性。•目前，转基因动物生产的药用蛋白有：（1）抗凝血酶III、（2）a1-抗胰蛋白酶、（3）血红蛋白、（4）乳铁蛋白、（5）磷脂蛋白、（6）长效tpA、（7）生长激素。如美国Genzyme公司培育出的tpA转基因山羊，每知羊奶中tpA的含量最高可达100克。•优点-------能够持续不断地获得转基因药物。哺乳动物的基因动物克隆技术4：哺乳动物乳腺反应器工程•最理想的是将基因导入到哺乳动物的乳腺细胞，形成哺乳动物乳腺反应器，最后从动物的乳腺中获得基因药物。•目前，从转基因牛分泌的乳汁中可以获得含有（1）人白蛋白、（2）乳铁蛋白、（3）纤维蛋白源、（4）抗凝血酶等等基因药物。•英国罗斯林研究所的转基因羊，其乳汁中含有a1-抗胰蛋白酶，可用来治疗囊性纤维化肺病、肺气肿。哺乳动物乳腺反应器工程优点（1）通过乳汁获得药物，能够获得较高的产量，同时也容易提纯。（2）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不会参与体内循环，也不会影响转基因动物自身的生理代谢过程。（3）乳汁所表达的蛋白质经过修饰加工之后，具有稳定的生物活性。（4）对于牛、羊这些大量分泌乳汁的动物来说，动物本身就相当于一座大型的药物工厂。三：动物细胞基因在植物中的表达•动物细胞基因在植物中的表达就是植物生物反应器。•随着基因工程研究技术的不断深入，国外已经有十几种动物性的蛋白质、多肽可以在植物中表达。1、植物生物反应器实例2、动物细胞基因在植物中的表达中的优缺点1、植物生物反应器实例（1）•乙肝病毒表面抗原（HBsAg）在植物中转基因•大肠杆菌热不稳定性肠素菜B亚基（LT-B）在植物中转基因•诺沃克病毒外壳蛋白（Norwalkvirus）在植物中转基因•盖氏13单克隆抗体（Guys`13mAb）在植物中转基因----预防龋齿•谷氨酸脱羧酶（GAD）在植物中转基因----预防糖尿病•粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）在植物中转基因----预防感染•Leu-脑啡肽（Leu-Enkephalin）在植物中转基因----镇痛。1、植物生物反应器实例（2）•水蛭素（Hirudin）在植物中转基因----凝血酶抑制因子•表皮生长因子（EGF）在植物中转基因----刺激上皮细胞分裂•促红细胞生成素（EPO）在植物中转基因----调节红细胞水平•红鳟生长激素（Growthhormone）在植物中转基因----刺激生长•人血清白蛋白（Humanserumalbumin）在植物中转基因•人干扰素（HIFN-a-D）在花椰菜花叶病毒中转基因----抗病毒•a-天花粉蛋白（a-trichosantin）在烟草花叶病毒中转基因-----抑制艾滋病病毒。1、植物生物反应器实例（3）•血管紧张肽转化酶抑制剂（ACEI）在烟草花叶病毒中转基因----抗过敏反应•流感病毒血凝素和艾滋病毒抗原（HIV-1gp120）在烟草花叶病毒中转基因•疟疾抗原在烟草花叶病毒中转基因•口蹄疫病毒抗原和象鼻病毒抗原（HRV-14）在豇豆花叶病毒中转基因•水貂肠炎病毒抗原（MEV-VP2）在豇豆花叶病毒中转基因•犬细小病毒抗原（CPV-CP-VP2）在李痘病毒中转基因。2：动物基因在植物中的表达中的优缺点优点：（1）可以减少纯化过程而大降低了成本，（2）通过植物生物反应器方式，人们只须通过吃水果、蔬菜等方式来替代打针、吃药。（3）将植物生物反应器与植物的组织培养结合起来，就可以在组织培养车间生产有价值的转基因药物。缺点：外源蛋白质在植物中的表达水平还不高。四：基因重组疫苗1、基因疫苗的生产方法2、基因疫苗的种类和特征3、基因疫苗的优缺点1990年9月14日，美国国立卫生研究院（NationalInstitutesofHealth,NIH）正式批准安德生（W.F.Anderson）领导的治疗小组为一位因腺苷脱氨酶（ADA）基因缺陷而出现严重综合性免疫缺陷症（SCID）的４岁女孩作基因治疗。安德生采用白细胞培养，以带正常ADA基因的病毒感染白细胞，再将白细胞注入体内。到1991年5月，经7次注射，患儿体内ADA水平达到正常人的25％，免疫功能逐渐恢复。1、基因疫苗的生产方法•基因疫苗又称核酸疫苗、也称为裸DNA疫苗，其方法是：（1）将编码某种搞原蛋白的外源基因克隆到真核质粒之中。（2）将这种质粒作为疫苗注射到动物体内。（3）质粒的DNA转录产生蛋白质成为抗原，激活动物体内的免疫系统。达到免疫的目的。2、基因疫苗的种类和特征•目前，基因疫苗在治疗流感病毒、乙型肝炎、结核病、疟疾、狂犬病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、艾滋病、干细胞淋巴瘤、脑炎病毒等等方面已经进入研发阶段。•基因疫苗的特征：（1）基因疫苗既具有预防作用、又具有治疗作用。（2）既能激发机体产生免疫应答，本身又具有免疫作用。3、基因疫苗的优缺点•基因疫苗的优点：（1）基因疫苗的抗原结构接近天然构象。（2）抗原性强。（3）生产成本低。•基因疫苗的缺点：急需解决的是转基因生物安全性问题，必须保证质粒DNA不与宿主动物发生基因整合，以防止后代发生致畸作用和出现遗传病。五：基因治疗药物•帕金森氏病的患病原因是由于大脑丧失了产生多巴胺的细胞，其理想的替代来源是人体的胎儿组织，然而这种细胞的来源十分有限。•为此人们开始研究动物的胎儿细胞。通过基因重组技术，克隆牛的多巴胺生成细胞到大鼠体内，以期望能够大量生产多巴胺。第二节生物制药技术概论•一：从DNA→mRNA→Pr•二：细胞破碎技术•三：提取技术•四：分离纯化技术•五：灭菌技术•六：干燥技术•七：基因工程原理一：从DNA→mRNA→Pr•1：DNA的半保留复制•2：DNA转录成mRNA•3：mRNA逆转录成DNA•4：mRNA转译成蛋白质•5：蛋白质在细胞内的加工和修饰二：细胞破碎技术（一）物理方法（二）化学方法（三）新型技术和方法（一）物理方法1：研磨法----细胞在玻璃球、或者钢球之间被碾碎。2：捣碎法----在韦林氏捣碎机中，细胞被彻底捣碎。3：高压匀浆法----细胞被强近性地通过小孔而剪碎。4：超声波破碎法----利用超声波的空穴作用来破碎细胞。5：快速冰冻融化法----（二）化学方法1：渗透冲击法----在细胞液中加入2倍量的纯水，由于渗透作用，细胞外的水分进入细胞内，导致细胞膜胀破，而将内含物释放出来。2：干燥处理法----3：自溶法----4：酶处理法----多采用溶菌酶进行处理。此外，还有链霉菌酶、白细胞酶C也可用于进行酶处理。5：表面活性剂增溶溶解法----采用洗涤剂破坏细胞壁，使内含物释放出来。常用的洗涤剂有：（1）十二烷基苯磺酸钠阴离子洗涤剂，（2）含有铵盐、或者氯化十八烷基三甲基季铵盐的阳离子洗涤剂，（3）脂肪醇聚氧乙烯醚的非离子型洗涤剂。6：噬菌体作用法----7：电离辐射法----（三）新型技术和方法1：激光破碎法2：冷冻喷射法3：高速相向流撞击法三：提取技术•1：盐析法2：有机溶剂分级沉淀法3：等电点沉淀法4：结晶和重结晶法5：酶解法6：萃取法（本章节重点讲解）7：透析法8：吸附法9：过滤技术萃取法•（1）液-液萃取•（2）化学反应萃取•（3）其它萃取技术•（4）双水相萃取（1）液-液萃取•是利用一种溶剂将生物产品从发酵液中提取出来的过程。•萃取设备有离心萃取器。（2）化学反应萃取•（尚在试验之中）•05SFT-150超临界萃取反应仪（3）其它萃取技术•液膜萃取•反胶团萃取•电场强化萃取•超临界萃取•凝胶萃取所有这样技术尚在实验室阶段，还没有应用于工业生产。（4）双水相萃取•由于生物大分子在加入有机相之后常常会失活，因此出现了双水相萃取技术。如用聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dex），在水中可以形成密度不同的二相。这二相之间互相不溶混，同时二相中的水溶液均超过70%。所以称之为双水相。能构成双水相有还有聚乙二醇（PEG）和无机盐。•双水相萃取的回收率一般在80-90%之间，其特点是清除细胞碎片的能力较强。另外，由于聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dex）对蛋白质很稳定，即使在常温下进行操作也不会导致蛋白质失活。四：分离纯化技术（一）：膜分离技术（二）：层析技术（三）：电泳技术（一）：膜分离技术1：渗透法2：反渗透法3：超滤技术4：电渗析法5：多孔陶瓷膜分离法6：渗透汽化法3：超滤技术（1）微滤法，其滤膜的孔径为0.05—2.0um之间，可阻留分子量为20-100万的物质，所需要的压力在0.1Mpa以下，适用于细菌、微粒的过滤，（2）超滤法，也称为错流过滤，其滤膜的孔径为0.0015—0.20um之间，可阻留分子量为3-50万的物质，所需要的压力在0.1--0.3Mpa，适用于大分子蛋白质与小分子有机物的分离，（3）纳滤法，其膜孔径为纳米级细孔，能截流的最小分子为1nm，截留分子量为200—1000。所需要的压力在1.50Mpa。可用于分子量相差无几的氨基酸之间的分离。（二）：层析技术•层析技术用于目的产品的高效分离和纯化。•根据层析所使用的介质不同，可分为1：无机基质分离介质2：有机高分子基质分离介质。1：无机基质分离介质•以多孔硅胶、可控孔径的玻璃、氧化锆、氧化铝、羟基磷灰石为主要载体所制成的球形、或者无定形颗粒。（1）可控孔径的玻璃的化学成份中SiO2，其表面可以通过涂层来进行性能上的修饰。（2）对于多肽药物的纯化分离，为了获得较高的分离效率。常常选用孔径在25nm以上的球形硅胶介质。常用的亲水凝胶介质，几乎都是二醇型化学键合硅胶。（3）羟基磷灰石（HAP）与生物体有很好的相容性，已经用于蛋白质、柱子酸的分离。球形的羟基磷灰石产品有KOBECERAM、HASI，片形的羟基磷灰石产品有中科院生化所生产的产品。羟基磷灰石（HAP）用于生物制剂分离纯化的例子有：细胞蛋白、病毒和亚细胞颗粒、细菌蛋白、精蛋白、重组蛋白、核蛋白、水解酶、异构酶、转移酶、氨基酸、多肽、多糖。无机基质分离具体方法（1）离子交换层析，其