实验方案

广谱抑菌乳酸菌素的纯化及其功能基因的克隆表达研究一、乳酸菌的分离、筛选及生理生化检测1.菌种的分离1.1样品的处理配置250m无菌水，在操作台中将样品放置锥形瓶中。37℃摇床1小时。1.2培养基乳酸菌分离培养：MRS、Elliker、BS、LSA、CQ培养基。以上培养基均在121℃灭菌15min。1.3菌株的分离采用稀释平板涂布法对奶酪中的菌群进行分离，将样品用灭菌水做10倍梯度的稀释，吸取10-1，10-2，10-3三个稀释度，取悬液0.2mL分别涂布于5种固体平板上，每个梯度稀释液涂布4个平板，分2组置于有氧和厌氧条件下，37℃培养1-2d，转接划线培养2次将保存的菌种放至35℃冰箱恒温箱中培养，待菌落外形无较大变化进行液体富集。在无菌操作台上挑取特征明显，生长旺盛的菌落接种至以灭过菌的15mlMRS液体培养基试管中，37℃，培养24h。观察菌液浑浊取出，在无菌工作台上，取培养好的菌液于1.5mlEP管中以备提取DNA，另取菌液进行镜检。1.4革兰氏染色将已分离出的600株乳酸菌进行革兰氏染色初步确定为乳酸菌洗片→少许菌苔→晾干→结晶紫初染1min→水洗→晾干→碘液媒染30s→水洗→晾干→95%酒精脱色20s→水洗→晾干→番红复染→水洗→晾干→镜检。1.5菌种保藏对于镜检后的菌株进行甘油冷冻保藏。分别从液体培养的试管中取0.7ml菌液与0.5ml甘油混合在菌种保藏管中，摇匀后先放置在4℃冰箱中预冷24h。隔天将菌种放置-80℃冰箱中冷藏。1.6提取菌株DNA(1)将装有菌液的EP管置于置于离心机中12000r/min，离心5min，弃掉上清液；(2)加入0.2mlTE缓冲液稍微震荡一下，加入0.05ml溶菌酶L，微震荡，在水浴锅中加热10min，温度55℃；（3）取出后，先加入0.05ml蛋白酶K，再加入0.3mlSDS，放置55℃水浴锅中加热15min；（4）取出后，加入5molNaCl0.1ml。0.08mlCTAB，混匀，放置65℃水浴10min；（5）取出后加入0.25ml苯酚，0.25ml异戊醇混合液，12000r/min离心5min。取上清液，继续加入0.25ml苯酚，0.25ml异戊醇进行抽提，离心5min，重复2次；（6）取离心好后的上清液置于新EP管中，加入0.02ml醋酸钠后，加入与上清液等体积的无水乙醇0.2ml。放置4℃冰箱过夜；（7）去过夜的EP管进行离心5min，将离心管中的液体全部缓慢倒掉，继续加入0.5ml70%乙醇，离心5min，取出后继续倒掉液体，再加入0.5ml70%乙醇离心5min。将EP管晾干至无乙醇味，加入0.1mlTE缓冲液。放置-20℃冰箱保存。用于PCR扩增。1.716SrRNA基因PCR扩增和系统进化分析应用细菌16SrRNA通用引物（正向引物271:5’-GAGAGTTTGATCCTGGGTGAG-3’，反向引物1492r：5’CTACGGTACCTTGTTACGGA-3’）进行PCR扩增。PCR配方(25µl体系)2µl200µMDNTP0.5µlPrimer2.5µlbuffer(50µMKCI，100µMTris一HCI，调PH至8.3)0.5µlTaq酶lµl模板18µl双蒸消毒水PCR条件:扩增过程包括:95℃下变性4min，95℃下变性30s，51℃退火30s，72℃延伸lmin，循环35次，72℃延伸10mnin，最后4℃。30个循环。PCR产物纯化后，由上海生工生物科技有限公司采用用正向扩增引物直接测序。将测序结果提交到GenBank数据库中，序列同源性分析利用BLAST在线进行。从数据库获得相关属、相关种的16SrRNA基因序列，建立系统发育树。1.8rep-PCR指纹图谱分析（可以鉴定到种水平）指纹图谱所采用的引物所使用的引物为：BOX-AIR：5’-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’。PCR扩增程序95℃变性30s，40℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最终退火温度为72℃，5min。PCR产物经1.5%的琼脂糖分离，60V电压电泳5-6h。所得的电泳图谱以TIFF格式保存，然后采用凝胶分析软件对rep-PCR指纹图谱进行分析。1.9乳酸菌生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》进行几种主要鉴定：大分子物质的水解试验:1.淀粉水解试验无菌操作将活化好的菌种接种到灭好菌的淀粉培养基中，另做一个不接种的平板做空白对照；将平皿密封倒置于37e恒温培养箱中培养24h；观察细菌的生长情况，将平皿打开盖子,滴入少量碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板；观察菌苔周围有无出现无色透明圈来判断该乳酸菌是否可以水解。2．明胶液化实验将实验菌接种于基础培养基中，置37℃培养，以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中，等待对照管凝固后记录实验结果，反复观察对比多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。3、吲哚实验将试验菌接种至蛋白胨水培养基中,37℃下培养48h以上。在培养液中加入乙醚1～2mL，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂(加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察)，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。4、产硫化氢实验将普通滤纸剪成约0.5-0.6cm宽的纸条，长度根据试管和培养基（含半胱氨酸或胱氨酸的培养基）高度而定。用浓度为50~100g/L的乙酸铅将纸条浸透，然后置于烘干，放入培养皿或试管内，灭菌后备用。将新鲜试验菌培养物接种于培养液后，用无菌的镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧。试验中设空白对照，在未接种的试管培养上悬挂乙酸铅纸条。另外接种已知菌的阴性反应作对照。置于37℃培养培养1-3d，进行观察比较，纸条变黑为阳性反应。5、糖发酵实验将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入PY基础培养基中，分装含5mL培养基的试管。分别取0.2mL鉴定菌株接到灭菌后的碳水化合物培养基中37℃培养24h，振荡培养。检测时取培养液少许置于比色盘内，同时取未加碳水化合物的PY培养液作为对照，滴加试剂比较颜色的变化，记录产酸的强弱。二、产细菌素乳酸菌的筛选和鉴定2.1乳酸菌发酵液制备将选出的菌种接种到装有MRS液体培养基lmL的无菌1.5mLEp管中，密封，30℃静置培养72h。2.2指示菌菌悬液的制备根据不同状态的指示菌在LB培养基上进行固体培养24h。用接种环挑取指示菌1环接种于LB液体培养基，37℃静置培养24h，冰箱保存待用。2.3乳酸菌的抑菌实验2.3.1产抑菌活性物质乳酸菌的初筛采用纸片法。将培养好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌培养液OD600分别调整到0.17、0.19、0.10，各取100μL接种于LB固体培养基，涂布均匀，固定1h。加入灭菌滤纸圆片。取过滤灭菌的培养上清液50μL滴加到滤纸圆片上。平板于37℃培养12h。测量抑菌圈直径，每个菌株做三个平行实验，求均值。挑选出纸片周围具有较大抑菌圈及发酵产物具有广谱抗性的菌株进行下一步试验。2.3.2产抑菌活性物质乳酸菌的复筛-牛津杯法在培养皿中加25mLLB固体培养基，凝固后，分别吸取0.2mL指示菌稀释液于固体培养基中，用灭菌推棒涂抹均匀，在每个平皿中等距离放置牛津杯4个，每个牛津杯中加入200μL初筛出的乳酸菌上清液，于37℃培养12h。若在牛津杯周围出现抑菌圈，则表明该乳酸菌具有抑菌活性，并用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个菌株做三个平行实验，求均值。2.4抑菌物质的确定2.4.1酸抑制作用的排除用乳酸和盐酸分别调蒸馏水、MRS液体的pH值分别为3.0、4.0、4.5、5.0、6.0，做各种指示菌的抑菌实验，确定对照pH值。挑取发酵产物对5种指示菌都有抑菌作用的菌株，接种于1mLMRS液体，30℃静置培养24h，再取100μL到10mLMRS液体，30℃静置培养48h，1×104r/min离心1min后，测其pH值，并用1mol/LNaOH和1mol/LHCl将其离心发酵上清液调至对照pH值，做对各种指示菌的抑菌实验。2.4.2过氧化氢作用的排除过氧化氢酶溶解在50mmol/L的磷酸缓冲液(pH=7.0)中配成母液,加入到发酵液中使过氧化氢酶的终浓度为5mg/mL,在37℃水浴中温育2h后取出,检测过氧化氢酶处理后发酵液的抑菌活性。2.4.3蛋白酶解检测用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶对筛选出的菌株进行酶分解实验，先用1mol/LNaOH和1mol/LHCl分别调发酵液到胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适作用pH7.0，按1mg/mL加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，37℃水浴2h，再将pH值调回6.5（对照pH值），做对各种指示菌的抑菌实验。2.5产细菌素乳酸菌的鉴定通过rep-pcr已经将菌种进行种水平的鉴定，将重复的菌进行从大到小的范围缩小，方便细菌素菌株的鉴定。2.6生长曲线的测定本实验用分光光度计对已经鉴定产细菌素的细菌进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线(l)标记:取无菌大试管,用记号笔分别标明培养时间;(2)接种:(3)培养:将己接种的试管置摇床37e培养，分别培养相应时间后取出放入冰箱中贮存；(4)比浊测定:用未接种的MRS液体培养基作空白对照，选用6O0nm波长测定吸光值，同时测定pH值。记录。三、细菌素的最佳效果研究及纯化3.1细菌素纯化3.1.1粗提根据行Yang的方法进行：菌体培养液→70℃恒温水浴30min灭活酶→调pH至6.0→室温搅拌30min使细菌素吸附在细胞上→8000r/min4℃离心30min→收集沉淀→悬浮在5mmol/L磷酸钠缓冲液100ml中洗涤→8000r/min4℃离心30min→收集沉淀→悬浮于5ml的100mmol/LNaCl溶液→调pH为2.0→4℃电磁搅拌12h→10000r/min4℃离心30min→收集上清液→0.22μm无菌滤膜过滤。用截留分子量2000Da的透析袋在pH3.1的柠檬酸缓冲液中透析24h。3.1.2细菌素的SPSepharoseFastFlow离子交换层析（1）装柱：将保存于20%酒精中的25mLSPSepharoseFastFlow凝胶浊液静置待分层后去掉上清液，加入一定量的pH3.1，20mM的柠檬酸平衡缓冲液，待静置分层后再倾去上清液，重复几次使凝胶达到预平衡。装1.6×25mm封口层析柱时先将凝胶搅均，注意不要产生气泡，在层析柱中加入约lcm高的平衡缓冲液，然后将全部凝胶浊液沿玻璃棒倾倒入层析柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2-3cm后，打开底部出口，使凝胶继续沉降。待凝胶全部沉降形成明显的分界面后，轻轻沿玻璃棒加入平衡缓冲液，使液面达到层析柱口处，然后将转换接头装入层析柱中，距离胶面1mm高，注意不要产生气泡，然后打开恒流泵，接入平衡缓冲液平衡柱体至前后pH值相同。（2）加样：取透析好的细菌素样品0.5mL(浓度约为5mg/mL)，将转换接头入口管接入样品液中，注意不要进入气泡。打开恒流泵，使样品进入层析柱中，观察样品在胶体中分布是否均一，否则应重装柱子。（3）洗脱：待样品全部进入柱中后，接入含0.6NNaCl的洗脱缓冲液进行洗脱，同时开始收集流出液。调整洗脱流速约为1mL/min，2mL/管分部收集，洗脱过程中同时检测蛋白质浓度即紫外吸收值A280nm。3.1.3细菌素的SephadexG-50凝胶层析（1）凝胶溶胀：将交联SephadexG-50置于烧杯中，加入pH3.1，20mM的柠檬酸平衡缓冲液，沸水浴煮1-2h（此为加热溶胀，如在室温下溶胀需6h以上），加热过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。凝胶颗粒大小要求均匀，使流速稳定。凝胶充分溶胀后待冷却至室温用倾泻法将不易下沉的较细颗粒除去。如此反复洗涤2-3次，进行装柱。（2）装柱：将洗净的1.5×50mm的层析柱垂直固定安装好，并与凝胶层析仪相连，关闭出口，加入洗脱液约lcm高，将处理好的凝胶搅成浆状，将已溶胀的凝胶沿着