限制性核酸内切酶(2)剖析

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶一、概念核酸酶：催化核酸酯键的水解。核酸外切酶:作用于核酸链的末端（3′端或5′端),逐个水解下核苷酸。核酸内切酶：从核酸分子内部切断3′,5′-磷酸二脂键。限制性内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶，可用于特意切割DNA,常作为工具酶。二限制性内切酶的类型根据限制性内切酶的识别位点和切割位点以及所需要的辅助因子，一般可将目前已鉴定出的限制性内切酶分为3种不同类型。•I型：切割位点不确定，不适用于基因工程。•Ⅱ型：基因工程的工具酶。•Ⅲ型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作亦无实用意义。核酸限制性内切酶不同类型比较特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链。位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3‘端24—26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用用途不大三限制性内切酶的作用机制•限制性内切酶以环状或线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3′-羟基和5′-磷酸基的DNA片段。四限制性内切酶的识别序列•EcoRⅠ的识别序列GAATTC•CTTAAG•HindⅢ的识别序列AAGCTT•TTCGAA•BamHⅠ的识别序列GCATCC•CCTAGG•从以上举例的各种限制性酶切酶的识别序列看出，它们具有共同的规律性，呈旋转对称或二重互补对称。•有的限制性酶切酶可识别两种以上的核酸序列。•另外有一些限制性酶切酶随然来源不同，但是具有相同的识别序列，这样的限制性内切酶被称为同裂酶。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤Y代表嘧啶。同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。五限制性酶切酶切割DNA的位点从切割位点处切开双链DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端（不易重新连接）。粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割，有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端粘性末端和平齐末端的动画对比DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度六影响限制性内切酶活性的因素①纯化DNA②加大酶的用量③延长酶催化反应的保温时间④扩大反应体积（20l）一般采取以下措施大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒2.DNA的甲基化程度dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。酶最适温度oC酶最适温度oC酶最适温度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.温度4.DNA的分子结构DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA量高出很多倍。是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。5.缓冲液化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度Tris-HCl：维持pH二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号活性。七限制酶的用途•DNA重组•限制酶（物理）图谱绘制•突变分析（RFLP分析）•限制酶的部分酶切与完全酶切Thanksforyourattending！