现代生物技术综合实验

现代生物技术综合实验（生技11级）周玉萍13710642138短号：662138本课程实验项目（54学时）实验1、质粒DNA的制备与质量鉴定（包含琼脂糖凝胶电泳）实验2、质粒DNA的片段化与分离实验3、大分子DNA的制备和质量鉴定实验4、PCR反应实验5、PCR产品纯化及克隆实验6、感受态细胞制备及转化实验7、利用不同的方法筛选和鉴定转化子（综合设计实验，18学时）实验要求两人一组，独立实验每次实验完成均要求写实验报告及思考题不得旷课，特殊情况可补实验每次实验安排2人配制琼脂糖凝胶本课程考核前6个实验共计50分（实验报告和思考题）（本部分成绩也是《基因工程》的平时成绩）综合实验（包括设计报告）共计50分实验一质粒DNA的制备与质量鉴定一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会完全分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物，通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中，再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质，混杂的RNA可用RNA酶(RNAase)消除。三、实验材料与主要试剂实验材料：含pEGFP质粒的大肠杆菌DH5α主要试剂：溶液I：50mM葡萄糖，10mMEDTA，25mMTris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4mg/L溶液II：0.2mol/LNaOH溶液（内含1%SDS）,现配现用溶液III（pH4.8）:60mL5mol/L醋酸钾，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O；饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V）TE缓冲液（pH8.0）:10mMTris-HCl，1mMEDTA，含RNA酶（RNaseA）:20µg/ml醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇四、实验步骤1)吸取1.4ml菌液至1.5ml离心管中。2)离心(8000r/min，1min)，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复1~2次）。3)加入150µL溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。4)加入200µL溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。5)加入150µL预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5min。6)离心(14000r/min，5min)，移取上清液于另一干净离心管。7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14000r/min，5min)，溶液将出现分层。8)移取上层水相溶液（约450~500µL）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14000r/min，5min)，溶液将出现分层。9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。10)离心(14000r/min，10min，4℃)，倒掉上清液。11)加0.5ml预冷的70%酒精振荡，洗DNA沉淀一次，离心5min，倒掉上清液。12)真空抽干或室温自然干燥.13)加20~30µLTE缓冲液使DNA完全溶解，室温放置10min，降解RNA杂质，少量用于琼脂糖凝胶质量检测，剩余质粒-20℃保存备用。14)1%琼脂糖凝胶配制：称取1g琼脂糖粉末，加入100ml0.5倍TBE溶液，加热熔化，稍降温后，加入5µL溴化乙锭（EB），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。15)每位同学各取5µL质粒DNA加入1µL6×loadingbuffer，混匀，进行点样。16)电泳条件：120v，40min；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照记录。五、实验结果观察并分析电泳图片六、实验报告按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。实验二质粒DNA的片断化及分离一、实验目的1、学习利用紫外分光光度法鉴定DNA质量2、采用Ⅱ型限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果。二、实验原理DNA吸收光谱峰在260nm处，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD260=1时，双链DNA含量约为50µg/mL，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA含量。由于蛋白质吸收峰在280nm处，在测定DNA含量时，通过计算OD260/OD280值，可了解所测DNA的纯度，如该值为1.8～2.0时，DNA纯度高。已知Ⅱ型限制性核酸内切酶能专一识别碱基序列，并在该处切断双链DNA，形成一定长度和序列的DNA片段。酶切反应需Mg2+等金属离子以及一定浓度的盐离子，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高（﹥5%），会使酶的识别位点发生改变，产生星活性。绝大多数酶的反应温度37℃。三、实验材料：实验一提取的质粒DNA四、试剂限制性核酸内切酶XbaI；缓冲液10×MBuffer；0.1%BSA;0.5×TBEBuffer；1%琼脂糖五、实验步骤1、DNA的测定空白测定(Blank)：吸取200µlTE缓冲液至比色杯，进行空白测定。DNA测定(Sample)：取质粒DNA1µl至一干净的离心管，加入199µlTE缓冲液稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定260nm及280nm的光吸收值；计录DNA浓度及OD260/OD280比值。2、酶切反应酶切反应液的配制:XbaI1μl10×Mbuffer2μl0.1%BSA2μlDNA5μl(根据质粒浓度来确定用量)ddH2O10μl酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。3、电泳检测反应结束后，向反应液中加入2.5μl10×loadingbuffer，混匀，用以停止酶切反应，所有22.5μl样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：120V,20分钟左右。六、实验结果观察并分析电泳图片。七、实验报告按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。实验三大分子DNA的制备和质量鉴定一、实验目的采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从植物组织中提取基因组DNA，并进行DNA纯度分析和琼脂糖凝胶电泳检测。二、实验原理核酸是生物有机体的重要成分，在细胞中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。在浓NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。分离得到核蛋白后，可用氯仿等将蛋白等杂质除去。有效制备大分子DNA的两个原则：1）防止和抑制内源DNase对DNA的降解。2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。三、实验材料：植物叶片约0.2克四、实验试剂1MTris-HCl(pH8.0)(提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏)CTAB分离缓冲液：2%CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，0.2%巯基乙醇(EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易从基因组DNA中除去)洗涤缓冲液：76%乙醇，10mmol/L乙酸铵氯仿-异戊醇(24:1)、异丙醇、TE缓冲液液氮五、实验步骤1.CTAB分离缓冲液置于60℃水浴中预热；2.2人一组，摘取0.5g叶片，置于研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎；3.取约0.2g叶片粉末加入到2.0mL离心管中，加入1ml预热的CTAB分离缓冲液，轻轻转动使之混匀；4.样品置于65℃保温30min；5.加等体积(1mL)的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀；6.室温下14000rpm离心10min；7.上层水相吸入另一干净1.5mL离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，静置5min，使核酸沉淀下来；8.室温下10000rpm离心10min；9.弃去上清液，加入500µL洗涤缓冲液，悬浮混匀；10.4℃条件下，14000rpm离心10min；11.在室温下使DNA沉淀干燥至周围透明，中间有少许白色为止；12.将DNA沉淀溶于20µLTE中，-20℃保存备用；13.取5uLDNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检查所提取DNA的完整性；14.利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度检测。（方法同实验二）六、实验结果基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片七、实验报告按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。实验四PCR反应一、实验目的了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。二、实验原理PCR技术是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR的过程：高温变性：将反应体系置于高温下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。低温退火：引物与模板链结合，形成部分双链DNA。中温延伸：TaqDNA聚合酶使引物从5′端向3′端延伸，4种dNTP掺入合成新的DNA互补链。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。三、实验材料质粒：pEGFP四、试剂1.10×PCRbuffer、rTaq酶2.dNTPmixtures：dATP,dTTP,dGTP,dCTP各2.5mM3.引物(2.5μM)GFP-F:5'-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-5'(Tm=65.5℃)GFP-R:5'-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'(Tm=61.5℃)4.2.0%琼脂糖凝胶五、实验步骤1、PCR反应混合液的配制(50μl)10×PCRbuffer5μldNTPmixture4μl前向引物(P1)8μl反向引物(P2)8μlDNA模板0.5μlrTaq酶0.5μl灭菌蒸馏水24μl所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加30μl矿物油覆盖。2、PCR仪的参数设置94℃4min94℃30sec40cycles61℃30sec72℃50sec72℃5min3、琼脂糖凝胶电泳检测反应结束后，取5μlPCR产品，加入1μl6×loadingbuffer，混匀后点样，电泳20min。其余45μlPCR产品保存在-20℃冰箱中，下次实验使用。六、实验结果观察并分析电泳图片七、实验报告按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。实验五PCR产品纯化及克隆一、实验目的学习PCR产物纯化的实验技术，掌握基因工程操作技术中最常用的T-A克隆方法。二、实验原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影响后续的DNA连接酶的连接反应;实验中可采用苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿依次使反应体系中的蛋白质杂质变性的方法纯化DNA产品，然后在酸性条件下用无水乙醇沉淀DNA。利用普通的TaqDNA聚合酶所扩增的PCR产物的3’-端具有一个A突出末端，T载体的5’-端具有一个T突出末端，二者正好互补，然后用T4DNA连接酶在体外将目的片段与线性化载体连接的方法称为T-A克隆。三、实验材料实验四的PCR产品pMD19-TVector四、试剂TE缓冲液苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)、氯仿醋酸钠（pH5.2）、无水乙醇、70%乙醇T4DNA连接酶混合物(SolutionI)五、实验步骤1、PCR产品纯化①将PCR产品（约45μl）小心转入1.5ml离心管中，加入55μlTE缓冲液