利用高通量药物筛选系统研究葡聚糖衍生物的抗乳腺癌活性

·药物研究·利用高通量药物筛选系统研究葡聚糖衍生物的抗乳腺癌活性石卫武１，蒋　明２，黄金麟２，曹建华２，黄思罗２，刘剑峰２（１．浙江省台州医院中心实验室，临海　３１７０００；２．华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所中法联合药物研发与筛选中心，武汉　４３００７４）［摘　要］　目的　研究葡聚糖衍生物对乳腺癌的作用。方法　以肝素表达缺陷而稳定表达成纤维细胞生长因子受体（ＦＧＦＲ）的Ｆ３２细胞系和乳腺癌细胞系ＭＣＦ７、ＭＣＦ７ｒａｓ为模型，利用３Ｈｔｈｙｍｉｄｉｎｅ摄入技术，研究人工合成的葡聚糖衍生物对细胞生长的影响，并初步探讨其作用机制。结果　葡聚糖衍生物能够有效作用于ＨＳ／ＦＧＦ／ＦＧＦＲ复合物，但对两种乳腺癌细胞系具有完全相反的两种作用，即刺激ＭＣＦ７的生长而对ＭＣＦ７ｒａｓ则抑制生长。构效研究发现，磺酸基团和苯环是影响葡聚糖衍生物活性重要基团。结论　葡聚糖衍生物与肝素具有相似的性质，对细胞生长具有双重性。［关键词］　葡聚糖衍生物；乳腺癌；碱性成纤维细胞生长因子［中图分类号］　Ｒ９６７　　　［文献标识码］　Ａ　　　［文章编号］　１００４０７８１（２００７）１０１１２１０３ＡＳｔｕｄｙｏｆｔｈｅＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＤｅｘｔｒａｎＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓＳＨＩＷｅｉｗｕ１，ＪＩＡＮＧＭｉｎｇ２，ＨＵＡＮＧＪｉｎｌｉｎ２，ＣＡＯＪｉａｎｈｕａ２，ＨＵＡＮＧＳｉｌｕｏ２，ＬＩＵＪｉａｎｆｅｎｇ２（１．ＣｅｎｔｒａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＴａｉｚｈｏｕＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌｉｎｈａｉ３１７０００，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｉｎｏＦｒｅｎｃｈＪｏｉｎｔＣｅｎｔｅｒｏｆＤｒｕｇＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｅｘｔｒａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｏｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＨｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓＭＣＦ７ａｎｄＭＣＦ７ｒａｓａｓｗｅｌｌａｓＦ３２ｃｅｌｌｌｉｎｅ，ｗｈｉｃｈｉｓｄｅｆｅｃｔｉｖｅｉｎｈｅｐａｒｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｕｔｅｘｐｒｅｓｓｅｓＦＧＦＲｓｔｅａｄｉｌｙ，ｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｅｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃｄｅｘｔｒａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅ３Ｈｔｈｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｗｅｒｅｔｅｎｔａｔｉｖｅｌｙａｐｐｒｏａｃｈｅｄ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｓｙｎｔｈｅｔｉｃｄｅｘｔｒａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｗｅｒｅｓｈｏｗｎｔｏｍｏｄｕｌａｔｅｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＦ３２ｃｅｌｌｌｉｎｅｂｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅＨＳ／ＦＧＦ／ＦＧＦＲｃｏｍｐｌｅｘｏｎｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅ．Ｔｈｅｓｅｄｅｘｔｒａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｓｈｏｗｅｄｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｏｐｐｏｓｉｔｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅ２ｈｕｍａｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓ，ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｔｈｅＭＣＦ７ｃｅｌｌｓｗｈｉｌｅｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈａｔｏｆｔｈｅＭＣＦ７ｒａｓｃｅｌｌｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｓｔｕｄｙｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｓｕｌｆｏｎａｔｅａｎｄｂｅｎｚｅｎｅｒｉｎｇａｒｅｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｈｅｍｉｃａｌｇｒｏｕｐｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｄｅｘｔｒａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｄｅｘｔｒａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｗｅｒｅｓｈｏｗｎｔｏｂｅｐｒｏｖｉｄｅｄｗｉｔｈａｑｕａｌｉｔｙｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈａｔｏｆｈｅｐａｒｉｎｉｎｔｈａｔｔｈｅｙｓｈｏｗｄｕａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｎｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ　Ｄｅｘｔｒａｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ；Ｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ；Ｂａｓｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）　　乳腺癌已经成为威胁女性健康的重大疾病之一，而多糖在乳腺癌细胞的增殖、分化和迁移中具有十分重要的作用。肝素能够促进多种生长因子与受体结合，从而促进乳腺癌细胞的生长。从天然产物中提取的多糖或利用化学方法获得的多糖衍生物作为竞争性抑制剂，特异性阻断肝素与细胞表面的蛋白质结合，是［收稿日期］　２００６１２０５［基金项目］　国家自然科学基金资助项目（基金编号：３０２７０６６６，３０１０００９２）、湖北省杰出青年基金资助项目（基金编号：２００４ＡＢＢ００５）、湖北省科技攻关项目（基金编号：２００３Ａ３０３Ｂ０２）［作者简介］　石卫武（１９７５－），男，浙江仙居人，主管技师，学士，从事基础实验工作。电话：[phone]，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]。开发抗癌药物的新策略。目前这类分子的抗癌作用研究已经取得了较好的进展，其中用化学合成法获得的葡聚糖衍生物对乳腺上皮细胞ＨＢＬ１００中的碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）通路有明显的抑制作用［１］。然而，多糖分子与肝素具有相似的结构，因此也可能表现出与肝素相似的功能从而刺激细胞的生长，从而给这类药物的开发带来一定的限制。笔者利用由造血细胞系ＢａＦ３转染成纤维细胞生长因子受体（ＦＧＦＲ）表达载体而获得的Ｆ３２细胞系、乳腺癌细胞系ＭＣＦ７和ＭＣＦ７ｒａｓ（多种人类肿瘤以ｒａｓ癌基因表达改变为特征，越来越多的证据表明ｒａｓ表达增强与疾病进展、肿瘤对传统治疗失效有关）。研究了人工合成的葡聚糖衍生物对细胞生长的影响，并初步探讨了其作用机制。·１２１１·医药导报２００７年１０月第２６卷第１０期其中，Ｆ３２表面没有肝素，是研究多糖衍生物的理想细胞模型。１　材料与方法　１．１　材料　合成用葡聚糖Ｔ４０购自Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司，耦联剂ＥＥＤＱ及肝素购自ＡｃｒｏｓＯｒｇａｎｉｃｓ公司，其余试剂为国产分析纯，超滤设备购自Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司，元素分析采用ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０４Ｂ型元素分析仪。Ｆ３２细胞系和人乳腺癌细胞系ＭＣＦ７、ＭＣＦ７ｒａｓ由本室保存，细胞培养所用ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ和ＦＢＳ购自ＧＩＢＣＯ公司，ｂＦＧＦ、青霉素和链霉素购自Ｓｉｇｍａ公司。ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴｒｉＬｕｘ购自ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ公司，３ＨＴｈｙｍｉｄｉｎｅ购自ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ。１．２　葡聚糖衍生物制备与表征　以葡聚糖Ｔ４０为原料，依次通过羧甲基化制备ＣＭＤ，苯甲胺化制备ＣＭＤＢ，磺酸基化制备ＣＭＤＢＳ；通过超滤纯化产物；通过电位滴定及元素分析表征产物［２］。１．３　细胞培养　Ｆ３２细胞培养于ＲＰＭＩ培养液（含１０％小牛血清，１０％ＷＥＨＩ３的细胞外液）；乳腺癌细胞ＭＣＦ７、ＭＣＦ７ｒａｓ培养于ＤＭＥＭ培养液（含１０％小牛血清）。细胞均３７℃、５％二氧化碳（ＣＯ２）、充分湿度条件下培养，每７ｄ传代一次。１．４　３ＨＴｈｙｍｉｄｉｎｅ摄入实验　Ｆ３２细胞接种于９６孔板，每孔２．０×１０４个细胞，以ＲＰＭＩ培养液（含１０％小牛血清，１０％ＷＥＨＩ３的细胞外液，０．１％ＢＳＡ）培养。５ｈ后，加入５ｎｇ·ｍＬ１ｂＦＧＦ２００ｎｇ·ｍＬ１肝素及不同浓度葡聚糖衍生物的培养液，继续培养７２ｈ。在结束培养前６ｈ，加入０．２μＣｉ·ｍＬ１３ＨＴｈｙｍｉｄｉｎｅ。ＭＣＦ７和ＭＣＦ７ｒａｓ细胞接种至２４孔培养板，每孔２．０×１０４个细胞。用不含ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养２４ｈ后，换成含５ｎｇ·ｍＬ１的ｂＦＧＦ和不同浓度葡聚糖衍生物的培养液，继续培养２４ｈ。在结束培养前４ｈ，加入０．１μＣｉ·ｍＬ１３ＨＴｈｙｍｉｄｉｎｅ。结束培养后用ＰＢＳ洗涤，用１０％三氯醋酸固定细胞，并用０．３ｍｏｌ·Ｌ１的氢氧化钠溶液裂解。使用ＭｉｃｒｏＢｅｔａ液闪仪测定３ＨＴｈｙｍｉｄｉｎｅ摄入细胞情况。２　结果　２．１　葡聚糖衍生物的合成与表征　葡聚糖Ｔ４０通过羧甲基化、苯甲酰胺化和磺酸化依次获得各种取代度的葡聚糖衍生物。见表１。２．２　葡聚糖衍生物对Ｆ３２细胞增殖的生理效应　结果见图１。由图１可知，在没有肝素时，ＱＥ１７和ＣＭＤＢ７均不能影响ｂＦＧＦ对Ｆ３２的激活。而外加肝素后，ｂＦＧＦ对Ｆ３２的激活将受到ＣＭＤＢ７和ＱＥ１７的抑制，且随浓度增强。２．３　葡聚糖衍生物对ＭＣＦ７及ＭＣＦ７ｒａｓ增殖的生理效应　结果见图２。由图２可见，在ＭＣＦ７细胞中，ＱＥ２１对细胞没有作用，ＱＥ１７和ＱＥ１８１则对细胞有明显的激活作用。在低浓度时，ＱＥ１７和ＱＥ１８１对细胞激活随浓度升高增强；在高浓度时，对细胞的激活随浓度升高降低。而在ＭＣＦ７ｒａｓ细胞中，低浓度的葡聚糖衍生物对细胞基本没有影响，高浓度的ＱＥ２１，ＱＥ１７和ＱＥ１８１则对细胞有明显的抑制作用。　表１　各种葡聚糖衍生物的化学成分含量分析结果％衍生物不同含量衍生物ＣＯＯＨ１Ｎ２Ｓ３ＣＭＤＱＥ２１４２－－ＣＭＤＢＣＭＤＢ７７０１．４４－ＱＥ１７８０３．１９－ＣＭＤＢＳＱＥ１８１－２．２４３．２０ＱＥ１８２－２．５１２．５１ＱＥ１９２３０１．５２９．２０ＱＥ２８２６０１．４０３．６０　　１通过电位滴定法测定羧基含量；２通过元素分析法测定氮含量；３通过元素分析法测定硫含量。图１　肝素对ＱＥ１７和ＣＭＤＢ７合成Ｆ３２影响的柱形图　Ａ．ＦＧＦ２；Ｂ．ＦＧＦ２＋Ｈｅｐａｒｉｎｅ图２　葡聚糖衍生物对ＭＣＦ７及ＭＣＦ７ｒａｓ增殖影响的柱形图Ａ．ＭＣＦ７（２４ｈ）；Ｂ．ＭＣＦ７ｒａｓ（２４ｈ）２．４　不同取代度的葡聚糖衍生物对细胞增殖的生理效应　结果见图３。由图３可见，ＱＥ１８１对ＭＣＦ７细胞增殖有着显著的激活效应，但在高浓度时减弱。在低浓度时葡聚糖衍生物对ＭＣＦ７ｒａｓ均无明显抑制，而在高浓度时，ＱＥ１８１，ＱＥ１８２和ＱＥ２８２对ＭＣＦ７ｒａｓ均有不同程度的抑制，且随时间增强。３　讨论　肝素对细胞的生长具有十分重要的作用。在乳腺·２２１１·ＨｅｒａｌｄｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅＶｏｌ２６Ｎｏ１０Ｏｃｔｏｂｅｒ２００７癌中，肝素能够促使ｂＦＧＦ与ＦＧＦＲ形成ｂＦＧＦ／ＦＧＦＲ／ＨＳ复合物［３］，从而引起细胞增殖。因此，利用多糖分子竞争性抑制肝素的作用是抑制乳腺癌细胞生长的有效策略。ＣＭＤＢ７作为肝素的有效抑制剂，可以干扰乳腺上皮细胞ＨＢＬ１００和成纤维细胞Ｂａｌｂｃ／３Ｔ３的ｂＦＧＦ自分泌环［１］。本研究采用Ｆ３２细胞系研究了葡聚糖衍生物对ｂＦＧＦ作用的影响。在肝素缺失的情况下，ｂＦＧＦ不能刺激细胞生长，即使外加葡聚糖衍生物也不能增强其活性，但是在外加肝素时ｂＦＧＦ能够显著地促进Ｆ３２生长，此时外加葡聚糖衍生物又能很好的抑制肝素的作用，且该效应随着浓度增加而加强。由此可见，葡聚糖衍生物的作用确为阻止ｂＦＧＦ／ＦＧＦＲ／ＨＳ的形成，从而抑制细胞生长。图３　不同取代度的葡聚糖衍生物对细胞增殖影响的柱形图Ａ．ＭＣＦ７（２４ｈ）；Ｂ．ＭＣＦ７ｒａｓ（２４ｈ）　　在ＦＧＦ存在下，外加的肝素对ＭＣＦ７具有促生长作用，而对分化程度较低的ＭＤＡＭＢ２３１却具有抑制生长的作用［４］。在另外的一些研究中，还发现低浓度的肝素可以刺激细胞生长而高浓度的肝素却抑制细胞生长。葡聚糖衍生物是否也具有相似的性质？本研究采用两种同源的细胞系ＭＣＦ７和ＭＣＦ７ｒａｓ对葡聚糖衍生