建立多能性干细胞株的方式与技术发展-中国畜牧学会

中國畜牧學會會誌，40(3)：141～157,2011建立多能性幹細胞株的方式與技術發展石力(1)(2)!!郭紘志(2)(3)(4)ၡࢋĈ從哺乳類胚中可分離出胚幹細胞（embryonicstemcell,ESC），胚幹細胞為具有分化多能性之幹細胞（pluripotentstemcell,PSC）；PSC與一般體細胞不同，具有自我更新（self-renewal）及分化多能性（pluripotency）的能力，在科學研究、臨床醫療及畜牧生產上有無限的應用潛力。由於建立ESC的過程往往必需犧牲完整的胚，在人類模式的應用上容易造成宗教、道德上的爭議。使用來自其他個體的ESC進行治療，則面臨免疫排斥反應的問題。為此，科學家發展出許多取得PSC的替代方式，以降低宗教、道德爭議及免疫排斥的問題。其中，應用體細胞核轉置（somaticcellnucleartransfer）法、孤雌激活（parthenogeneticactivation）法、單一胚葉細胞分離（singleblastomerebiopsy）法及多能性幹細胞誘導（pluripotentstemcellinduction）法取得PSC的技術最具發展潛力。經由上列方法建立PSC的方式、所得PSC的特性，與實際應用層面上，皆互有其優缺點。如何能以最有效率又不受爭議的方式，獲得所需之PSC，為目前研究發展所需要進一步努力的方向。（關鍵語：多能性、胚幹細胞、著床前胚、誘導式多能幹細胞、多能性再程序化）݈!!֏!哺乳動物自受精卵發育成個體，乃經由有絲分裂發育為二個、四個、以至於八個細胞期，此時的每一個胚葉細胞（blastomere）可能仍具有發育的全能性（totipotency），故可在適當的培養條件下，發育成一個完整個體。當胚胎發育至十六到三十二個細胞的桑椹期胚時，細胞不對稱分裂形成內外層細胞之區隔，胚葉細胞之全能性開始喪失，細胞大致上分化為內細胞群（innercellmass,ICM）及滋養層細胞（trophoblast），並繼續發育為囊胚（blastocyst）時，可以從ICM中建立胚幹細胞（embryonicstemcell,ESC）。在適當特定的培養條件下，ESC具有無限增殖而不分化的特性，稱為自我更新（self-renewal）能力；同時也具有分化成個體各類細胞的能力，稱為分化多能性（pluripotency）。ESC於體外培養，可以分化為不同胚層的組織；將其移植到免疫不全小鼠（severecombinedimmunodeficiencydisease,SCID,mice）時，可形成具有內、中、外胚層結構的畸胎瘤（teratoma）；若將ESC經由顯微注射到囊胚內，經胚移植後可生下嵌合動物（chimeras）。(1)國立中興大學動物科學系研究所，40254台中市南區國光路250號(2)中央研究院細胞與個體生物研究所，11529台北市南港區研究院路二段128號(3)中央研究院基因體研究中心，11529台北市南港區研究院路二段128號(4)通訊作者，E-mail:[e-mail]中國畜牧學會會誌第40卷第3期142若將ESC注射到無法繼續發育的四倍體囊胚（tetraploidcomplementation），即可能使其發育為一個完整的個體。因此，ESC極具應用於動物無性繁殖、再生醫學、組織工程、器官修復、疾病機轉與藥物篩選等研究之價值。一般而言，建立ESC時，必需犧牲一個完整的胚。因此，以人類ESC進行科學研究及臨床治療，極容易引發道德、倫理與宗教上的爭議。此外，進行組織或細胞移植時，因個體間之主要組織相容性複合體（majorhistocompatibilitycomplex,MHC）不同，而產生免疫排斥現象（Drukker,2008；Zhaoetal.,2011），成為再生醫學研究發展上的重大障礙。為克服以上的問題，使用不同來源之多能性幹細胞（pluripotentstemcell,PSC）為解決方法之一。可應用之PSC必須具有自我更新能力、分化多能性並與細胞移植之個體相容，同時可避免宗教、道德爭議等敏感問題。可能的PSC（Green,2007；Kaoetal.,2008；Klimanskayaetal.,2008），有體細胞核轉置胚幹細胞（somaticcellnucleartransferredESC,ntESC)（Rideoutetal.,2002）、孤雌生殖胚幹細胞（parthenote-derivedESC,p-ESC）（Revazovaetal.,2007）、誘導式多能性幹細胞（inducedpluripotentstemcell,iPScell)（TakahashiandYamanaka,2006）以及單一胚葉胚幹細胞（singleblastomere-derivedESC,sbESC）（Chungetal.,2006）等（圖1），茲將其重點分述如下。˘ăវ௟ࡪ८ᖼཉࡣ຅௟ࡪ體細胞核轉置（somaticcellnucleartransfer,SCNT）乃將已分化的體細胞核轉置入經去除細胞核的卵中進行再程序化（reprogramming），並給予適當的外源性激活（activation）後，成為重組胚。此重組胚可植入代理孕母子宮內，繼續發育為完整的個體。自首例複製動物桃莉羊誕生後（Wilmutetal.,1997），目前大多數的家畜或試驗動物皆可以此一模式產製。Ğ˘ğវ௟ࡪ८ொཉԫఙٺГϠᗁጯ۞ᑕϡ利用SCNT複製的囊胚，可用於胚幹細胞或類胚幹細胞（ES-likecell）之建立。在小鼠（Wakayamaetal.,2001）及非人靈長類動物（Byrneetal.,2007）上，皆有成功的例證。在小鼠模式中，曾經有研究利用經基因修正之ntESC進行體外分化（invitrodifferentiation）所得之造血前驅細胞（hematopoieticprecursor）進行細胞代替治療，發現雖然ntESC與細胞接受者具有相同的MHC表現，可避免由細胞毒素T細胞（cytotoxicTcell）及B細胞（B-cell）所引起之免疫排斥反應，並成功產生免疫細胞，但仍然可能受到自然殺手細胞（naturekillercells,NKcells）之排斥（Rideoutetal.,2002；Hsiehetal.,2010）。直到目前為止，在人類模式尚無成功建立的報告發表（Hwangetal.,2005；Snyderetal.,2006；Frenchetal.,2008；Baylis,2009）。近來，科學家利用未去核之人類卵接受體細胞核，可成功使其再程序化，並建立攜帶三套染色體（體細胞兩套，受核卵一套）的ntESC（Noggleetal.,2011）。顯見於去核過程所移除之卵母細胞核，可能於再程序化過程扮演重要角色。但此法在實務上，面臨低效率與人類卵取得不易等問題，不易建立最佳化的試驗參數及條件，使此一研究更加困難。Ğ˟ğ჌มវ௟ࡪ८ொཉ!為獲得足夠的試驗材料，利用非人類卵作為受核細胞接受人類細胞核之種間體細胞核轉置（interspeciesSCNT,iSCNT），以產製複製胚，建立ntESC（Chenetal.,2003）。雖然該團隊宣稱以建立多能性幹細胞株的方式與技術發展143圖1建立多能性幹細胞的方式。!Fig1Methodstoderivepluripotentstemcell(PSC).(a)Theconventionalwaytoderivepluripotentstemcellrequiresthedestructionofintactembryos,whichmaycauseethicalissue.Severalalternativemethods(b-e)weredevelopedinordertoestablishimmune-compatiblePSCwithlessethicalconcern.(ModifiedfromGreen2007;Kaoetal.,2008;Klimanskayaetal.,2008)!中國畜牧學會會誌第40卷第3期144此方法成功建立ntESC，但並無其他團隊得以重複其結果，因此以iSCNT的方式獲得ntESC的方法之可行性仍待進一步驗證（Chungetal.,2009）。英國人類受精與胚胎學管理局（HumanFertilizationandEmbryologyAuthority,HFEA）有鑑於此類研究有助於解決受核卵不足的問題，於2007年立法同意iSCNT的進行。此種利用非人類卵子作為受核卵，雖能解決試驗材料的不足，但考慮到大眾觀感及種間遺傳物質相容性所可能引發的免疫排斥現象，iSCNT目前主要應用於探討細胞核與卵子細胞質交互作用的機制（Einsiedeletal.,2009）。iSCNT的另一個重要應用，在於利用家畜動物之卵母細胞做為受核卵，進行瀕臨絕種哺乳類野生動物的保存，截至目前為止，曾經有野羊（moulfon）及灰狼（graywolves），甚至是已絕種的野羚羊（bucardo）皆可經由iSCNT的方式生產複製動物（Loietal.,2001；Kimetal.,2007b；Folchetal.,2009）。利用SCNT胚建立人類ntESC，由於牽涉到的倫理道德與宗教問題，仍有諸多爭議，且未受精卵的來源不足亦有疑慮，加上其他替代方式的快速發展，使得目前SCNT於再生醫療上所扮演的角色相對受到競爭與挑戰。˟ă؝ᅬϠതࡣ຅௟ࡪ孤雌生殖係指卵未經受精過程即直接進行發育的生命現象，普遍發生於許多魚類、昆蟲類、兩棲類及爬蟲類的繁殖模式；但是在哺乳類中，尚無法以孤雌生殖的方式進行繁衍。哺乳類卵母細胞，可以在體外經由外源性刺激模擬受精過程激活，使其發育成著床前胚的形態。Ğ˘ğ؝ᅬϠതࡣ൑ڱҋ൒јࠎ࣎វ在小鼠（mouse）、兔（rabbit）、豬（pig）、綿羊（sheep）、牛（cattle）及絨猴（marmosetmonkey）等動物的研究上，若將孤雌生殖所得的胚移置到子宮，雖可著床發育，但是懷孕狀態只能維持到正常懷孕期的三分之一到二分之一，胚胎便無法繼續發育（BreviniandGandolfi,2008）。在人類上雖然由於道德因素無法進行類似的研究，但是目前並無任何跡象顯示，在人類模式上會有不同的結果。由於孤雌生殖胚的發育，沒有經過受精，Igf2,Snprn,H19與Igf2r等銘印基因的表現異於受精胚，使得孤雌生殖胚無法正常發育為個體（Allenetal.,1994；Hsiehetal.,2010）。若藉由基因工程調控銘印基因於小鼠孤雌生殖胚中的表現使其接近受精胚，孤雌胚胎有機會發育為個體（Konoetal.,2004；Wuetal.,2006）。綜合以上，於自然發育或基因未產生突變之狀況下，哺乳動物之孤雌生殖胚，可視為由生殖細胞發育而來的生命現象，而非經由正常受精作用，所發育成的完整個體。若應用於建立p-ESC，亦有機會降低犧牲一個完整的生命所引發的道德爭議。Ğ˟ğ؝ᅬϠതࡣ຅௟ࡪ̝পّ!目前於小鼠（Kaufmanetal.,1983）、非人靈長類（Cibellietal.,2002）、家兔（Fangetal.,2006；Hsiehetal.,2011），甚至人類（Revazovaetal.,2007）的研究，皆可成功建立p-ESC。p-ESC可表現大多數的胚幹細胞標幟基因，將其注入免疫缺陷小鼠體內，可分化為具有三個不同胚層組織的畸胎瘤，與各物種自受精胚所得之ESC或ES-likecell相似。小鼠p-ESC雖具有形成嵌合體、性腺遺傳的能力，但將p-ESC進行tetraploidcomplementation，則無法生下完全由p-ESC所建立多能性幹細胞株的方式與技術發展145形成之小鼠（Allenetal.,1994）；若利用銘印基因表現異常之小鼠p-ESC進行，則有機會生下存活的仔鼠（Chenetal.,2009）。可見父方銘印基因的不表現，對於p-ESC之分化能力有重