动物细胞工程制药

动物细胞工程制药张忠山生命科学学院•一、概述•二、动物细胞的形态和生理特点•三、生产用动物细胞的要求和获得•四、动物细胞的培养条件和培养基•五、动物细胞培养的方法和操作方式•六、动物细胞生物反应器及其检测控制系统•七、动物细胞制药的前景和展望第一节概述•（1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。•（2）组织培养或细胞培养。1885年德国生理盐水培养鸡胚组织，至1907年，细胞体外培养宣布进入一个新时代。•（3）细胞工程学时代。对细胞进行人工改造及培养以使其为人类服务的时代，包括真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理论和技术。•（4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。应用领域•生产药品：作为宿主细胞表达生产原核细胞所不能生产的药用蛋白。•基础研究的细胞材料：细胞模型•种子细胞：为组织修复与器官再生提供种子细胞。第二节动物细胞的形态和特点•一、动物细胞的形态•二、动物细胞的生理特点一、动物细胞的形态细胞的分化（或特化）形态分化在离体培养同样也存在。离体培养的细胞分为两类：贴壁依赖型（anchorage-dependent）和非贴壁依赖型（anchorage-independent），前者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。动物细胞结构图•1、贴壁细胞特点：支持物两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。•2、悬浮细胞这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。•3、兼性贴壁细胞兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细胞，如CHO细胞、小鼠L929细胞。当它们贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。二、动物细胞的生理特点•1、细胞的分裂周期长一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期S期：DNA的合成，一般为6~8小时•G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，持续时间短，一般为2~5h。•M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞。•细胞分裂代数与培养中的代数及相互关系。•2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象•大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附，伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。•当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止增殖。保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生长，细胞密度可大大增加。•3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的•当细胞培养开始，称之为原代培养，经过传代后，即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。但是若向培养基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原来的50代增加至150代。•当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞系，或称连续细胞系。动物细胞培养一代生长过程4、动物细胞对周围环境比较敏感无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易产生影响。5、动物细胞培养基的要求高与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。•6、动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不同•场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体，前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多数为糖蛋白。•蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖，在高尔基体内加接的是O-链寡糖。动物细胞生产药物的优缺点•缺点：培养条件高、成本贵、产量低。•优点：分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。第三节生产用动物细胞的要求和获得•一、生产用动物细胞的要求•二、生产动物细胞的获得•三、常用生产用动物细胞的特性•四、基因工程细胞的构建和筛选•五、细胞库的筛选传代细胞的要求•正常原代细胞二倍体细胞无限制•癌细胞生产药物需谨慎！一、生产用动物细胞的要求•（1）原代正常组织分离的细胞•（2）二倍体细胞，即使是传代细胞•（3）传代细胞用于生产•（4）按照FDA对细胞株的要求，控制最终产品中DNA残留量。•1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般1g组织约有109个细胞。鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、淋巴细胞费钱费劳力•2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。•WI-38、MRC-5、2BS等•3、转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。•自发转化、人为转化•Namalwa、CHO、BHK-21、Vero等。•各单位细胞库保存•4、融合细胞系动物细胞融合技术----也称动物体细胞杂交技术，是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下，合并为一个多核细胞的过程。促融因素（1）病毒诱导融合（2）PEG诱导融合（3）电场诱导融合（4）其它诱导融合（1）病毒诱导融合•仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病毒等•当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病毒时，病毒或其组分会在细胞间起粘连作用而使细胞聚集成团，细胞膜上的蛋白质和脂质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。•随机的，无法人为控制，同时融合率较低。（2）PEG诱导融合•当二种不同的动物细胞混合物中存在PEG时，就会产生细胞聚集作用。在除去PEG的过程中，即产生细胞融合现象。•所用的PEG分子量在1000-6000之间，一般浓度为40-50%，在37℃下作用2-3分钟，其促融效果最佳。•PEG促融合的作用机理不清，其促融作用也具有随机性，无法人为控制。（3）电场诱导融合•将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电场作用时，细胞之间就会发生紧密接触，形成稳定的串珠状偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就会发生膜击穿，不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融合，形成一个双核或者多核的细胞。•一般来说，击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50微秒。•电场诱导融合不损伤细胞，具有可人为操作的控制的特性，融合率较高。三、常用生产用动物细胞的特性•（1）WI-38：1961年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系，核型2n=46。该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME（Eagle’sbasalmedium）加小牛血清，pH控制在7.2，同工酶为G6PDB型。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50代，上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。•（2）MRC-5：特性和用途与WI-38相似，1966年来源于14周正常男性，对多种人的病毒敏感，用于疫苗的生产。•（3）CHO-K1：1957年从中国地鼠卵巢中分离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨酸。核型为2n=20~22。目前广泛用于构建工程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株CHO-dhfr-，它常用的培养基为DMEM培养基，加0.1mol/L次黄嘌呤和0.01mmol/L胸苷，以及10%小牛血清。•（4）BHK-21：1961年从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经13次的克隆的细胞。成纤维细胞，2n=44。通常用的培养基为DMEM培养基，添加7%胎牛血清。过去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，现在已被用于构建工程细胞。•（5）Vero：1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率为1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于人体。•（6）Namalwa：1972年来源于肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞，高细胞有2.8%的高倍体率，多数细胞有12~14条标记染色体，单条X染色体，无Y染色体。通常用的培养基为RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于大规模生产-干扰素。•（7）SP2/0-Ag14：该细胞是1978年中通过融合的方法，从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合的杂交瘤SP2/HL-Ag亚克隆中分离得到。它不分泌任何免疫球蛋白抗体链，能耐受8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine）20g/ml，但在含HAT选择培养基中不能存活。通常用的培养基为DMEM培养基，添加10%胎牛血清。•（8）Sf-9：1983年从亲代IPLB-SF21AE中克隆形成。亲代细胞则在1977年从秋粘虫（Spodopterafrugiperda)的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒（AutographacaliforniaMNPV）和其他杆状病毒（Baculovirus）高度敏感。通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及10%胎牛血清。目前已经被广泛用于高效表达外来蛋白制品。四、基因工程细胞的构建和筛选•原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者在生产中都有使用，但在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种工程细胞。当前被用以构建工程细胞的动物细胞有CHO-dhfr-、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0和Sf-9等细胞。•那么如何获得动物工程细胞呢？1、真核细胞基因表达载体的构建•目前一般使用的载体有两类：一是病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒和逆转录病毒和杆状病毒等。牛痘病毒已被广泛地用来构建成多价疫苗，腺病毒和逆转录病毒载体正被试用用于基因治疗中，而杆状病毒载体-昆虫细胞系统已被成功地用于300多种外源基因的高效表达。•用杆状病毒做载体有许多优点：（1）该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组。（2）插入7~8kb的DNA不影响正常病毒粒子的形成。（3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子。（4）多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20~30%。（5）用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆。（6）如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。•另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。构建此类载体一般含有如下基本成分：（1）允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。多数含有质粒pBR322或其衍生载体pAT153的序列，包括能使质粒在细菌体内复制的起始位点和抗生素标记基因。•（2）含有能使基因转录表达的调控元件，在5’端转录起动需要有启动子，包括帽状位点（RNA转录起始点）上游约30碱基处的TATA框和上游70~90碱基处的CAAT框序列和增强子。当前构建载体的许多启动子序列都来自病毒。也有其它来源的启动子。此外，在基因3’端应有终止序列、RNA3’端的切割序列和polyA序列等。近来有人在载体里加入显性活动调控区（DCR）序列，以此来克服因载体整合在宿主基因组位点而产生的表达水平降低。