扫描电镜及其制样技术

扫描电镜技术TechniquesofScanningElectronMicroscope一、扫描电镜的基本结构与成像原理二、扫描电镜的特点三、扫描电镜的生物样品制备技术（一）样品的常规制备方法（二）特殊样品的制备方法扫描电镜技术扫描电镜（ScanningElectronMicroscope，SEM）是继光镜和透射电镜之后发展起来的一种电镜，用于观察物质表面及断面的三维形貌结构和进行微区成分分析。一、扫描电镜的基本结构与成像原理1、SEM基本结构及其作用（１）电子光学系统电子枪：阴极、阳极、栅极。阴极—通电加热后产生电子束。阳极—加速电子束。栅极—控制和会聚电子束流。电磁透镜：会聚电子束，形成直径5~10纳米的电子束（即电子探针），照射于样品上。图1-1扫描电镜工作原理图（２）检测系统①二次电子的来源及作用在样品表面以下几纳米到几十纳米的区域，被入射电子（初级电子、一次电子）所激发出来的样品原子中的外层电子，称谓二次电子（次级电子）。SEM通常是由二次电子所形成的图象来显示生物样品的表面形貌。（２）检测系统②二次电子检测系统的组成及作用组成：检测器（二次电子探头）、光电倍增管、视频放大器。作用：对二次电子进行收集、放大和处理，以调制显像管栅极电压并成象。图1-1扫描电镜工作原理图（３）电子偏转系统（扫描系统）组成：扫描发生器、扫描线圈。作用：使镜筒和显像管内的电子束分别进行同步光栅状扫描，最后在显像管的荧光屏上显示出完整图象。图1-1扫描电镜工作原理图2、影响图象形成的因素（1）倾斜角效应——二次电子成像原理∵二次电子产率主要取决于电子束的入射角，而入射角又主要取决于样品的倾斜程度。∴样品的倾斜角效应是影响图象反差的主要因素。∴SEM图象的反差主要是由样品表面的凹凸状态决定的，越是凸出的部位产生二次电子的数量越多，图象越明亮，反之则较暗。图1-2样品倾斜对二次电子产率的影响2、影响图象形成的因素（2）原子序数效应原子序数效应：样品内原子序数不同的元素，在图象上也会形成一定的亮度差异，这种现象称为原子序数效应。对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀一层原子序数高的金属膜，可提高图象质量。2、影响图象形成的因素（3）充放电效应充电：当初级电子轰击干燥的生物样品表面时，会因其导电性能差而发生电荷积累的充电现象，并对随后到来的初级电子产生排斥，使电子散开，且导致二次电子发射轨迹偏斜或杂乱。放电：轰击区内电子堆积，与邻近区域间产生电位差，则可产生放电打火现象。充放电效应：上述充、放电状况造成图象忽明忽暗或模糊不清等现象，称为充放电效应。对策：采用金属镀膜、导电胶粘贴样品等导电处理，可减少充放电效应的影响。图1-4血细胞充放电效应图例二、扫描电镜的特点（一）图谱（二）扫描电镜的特点观察表面形貌。图象景深大，富有立体感。放大范围广，分辨率较高：放大倍数为数10倍~数10万倍；分辨率取决于电子探针的直径，一般为5~10nm。可观察块状样品：0.5~10cm3。样品制备简单。可结合元素分析。三、扫描电镜生物样品制备技术（一）样品的常规制备方法取材→清洗→固定→清洗→脱水→干燥→金属镀膜→SEM观察1、取样取样部位要准确。取样大小要适当：常为≤1cm3。取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。样品的基底部应切割平整（以便于样品粘贴），观察面应作好识别标记。2、清洗（1）清洗的目的：充分暴露样品观察面的表面特征。（2）清洗液的选择常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液；特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织等）的初级清洗。（3）清洗的方法浸泡清洗。震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜等），可利用震荡器进行震荡清洗。离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。（4）清洗的要求样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净，以充分暴露表面特征。3、固定（1）固定的目的保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活状态。使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受表面张力变化的能力。提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。（2）常用的固定剂戊二醛：常用浓度为1~4%。锇酸：一般用1~2%浓度。（3）固定的方法先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清洗后，再用锇酸固定30~60分钟。4、脱水（1）脱水的目的用低表面张力且易挥发的有机溶剂（乙醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水，使样品在后续干燥处理时的表面张力减少。表1几种液体的表面张力单位：达因/cm液体乙醇丙酮水表面张力16.49（20℃）21.16（40℃）70.61(20℃）（2）脱水的方法PBS清洗3次，5~10min/次→乙醇梯度脱水到纯乙醇，5~30min/级。（3）脱水的要求脱水要彻底；严防发生空气干燥：在换液过程中，要始终保持样品润湿，以免因表面张力变化而造成样品的皱缩、塌陷或变形。5、干燥（1）干燥的目的彻底去除样品中的脱水剂，使样品干燥，以保护镜筒高真空和样品不变形。（2）干燥的方法1）空气干燥法2）真空干燥法3）冷冻干燥法4）临界点干燥法（2）干燥的方法1）空气干燥法方法：把样品放在空气中，让其中的脱水剂自然挥发掉，以达到干燥的目的。特点：脱水剂存在的低表面张力，仍使许多样品发生变形或收缩，故本法是在缺乏其他条件下不得已采用的干燥方法。（2）干燥的方法2）真空干燥法方法：在真空的条件下使样品中的脱水剂挥发掉。特点：效果与空气干燥时相同，仅是干燥的速度较快。（2）干燥的方法3）冷冻干燥法特点：在干燥过程中由于不形成液-气界面，所以由表面张力引起的样品变形和损伤大为减少，因此干燥效果较好。缺点：冷冻过程有可能形成冰晶损伤。图3-1冷冻干燥法技术流程（2）干燥的方法4）临界点干燥法①临界点干燥的原理（图3-2）图3-2临界点干燥原理图临界点干燥的原理之小结临界状态的条件：密闭容器中的液体加热达到一定的温度（临界温度）。临界状态的特性：气、液密度相等，相界消失；液体变成气体，液体的表面张力消失为零；无论施加多大的压力，气体不会变成液体。临界点干燥：利用临界状态下液体表面张力被消除的特性，使样品中的液体气化而最后完全干燥。②临界干燥液的选择——置换液与中间液置换液：在临界点干燥器内起临界干燥作用的液体称为置换液(表2)。表2某些液体的临界特性中间液：醋酸异戊酯名称水乙醇氟里昂液体CO2临界温度(℃)37424328.931.5临界压力(kg/cm2)218.5633872.8③临界点干燥器的主要结构（图3-3）图3-3HCP-2型临界点干燥器④临界点干燥的操作程序取样固定脱水醋酸异戊酯样品入室注入液体CO2置换气化放气取样(15~30min或过夜）(0~10℃)(0~10℃)(15~20℃)(35~40℃)(35~40℃)(10~20min)(5~10min)(30min)图3-4临界点干燥过程6、粘样（样品的粘贴）（1）目的：将样品粘牢在样品台上。（2）粘样材料双面胶带：用于粘贴基底部平整或颗粒状的样品。导电胶：是银粉拌在低电阻树脂内制成的糊状物，用于粘贴基底部不平整的样品。7、金属镀膜在样品表面喷镀一层厚约3~30nm的金属薄膜。（1）镀膜的目的①提高样品表面的导电性。②提高二次电子发射率。③减少电子束对样品的损伤。（2）镀膜材料的选择金、铂、金/铂合金、铂/钯合金。（3）镀膜的方法目前常用离子溅射法镀膜。7、金属镀膜1）离子溅射法①离子溅射仪的主要结构②离子溅射镀膜的原理辉光放电→离子溅射→漫散射镀膜③镀膜厚度的控制：溅射时间的选择8、电镜观察图3-6离子溅射仪及原理图（二）特殊样品的常规制备方法1、游离细胞的制样方法（1）将盖玻片洗净灭菌，样品面做标记；（2）将盖玻片垂直浸入热溶的2~5%明胶后即刻垂直取出，用滤纸吸去边缘多余的明胶；（3）将盖玻片的样品面朝上平放在滤纸上，于37℃干燥箱烘干后备用；（4）在盖玻片样品面上滴1~2滴细胞悬浮液，静置20min左右，用滤纸吸去表面残存的悬浮液。（5）用2%戊二醛固定30min，PBS清洗3次。（6）常规方法脱水、临界点干燥、粘样和镀膜。SEM样品的常规制备方法小结1、SEM样品的常规制备步骤取材→清洗→固定→清洗→脱水→中间液替代脱水剂→临界点干燥→粘样→（金属）镀膜→SEM观察2、SEM样品制备的基本要求与原则（1）样品观察面要处理干净，以充分暴露表面特征；（2）保护样品观察面，以保持原状不变形；（3）样品要彻底干燥，以保护镜筒的高真空和样品的形态结构；（4）样品要作导电处理，以减少充放电效应和提高二次电子发射率。复习题1、扫描电镜的特点2、临界点干燥的原理3、金属镀膜的目的4、SEM样品的常规制备步骤5、SEM样品制备的基本要求与原则