第10章 转基因植物

第十章转基因植物主要内容一、转基因植物受体转基因方法转基因植物鉴定二、基因改良植物抗虫害植物抗除草剂植物高品质植物三、转基因植物生物制药四、转基因植物的安全性问题一、转基因植物转基因植物(transgenicplant)是指将外源基因转入到植物的细胞或组织中获得的具有新的遗传性状的植物。一、转基因植物通过植物基因工程获得转基因植物在农业生产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的意义，已获得的有重大经济价值的转基因植物已经很多。一、转基因植物基因工程：就是重组DNA技术，指在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组，形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特性，产生新的基因产物。技术路线目的基因分离植物表达载体的构建受体材料的准备遗传转化转化组织组织脱分化转化植株筛选炼苗一、转基因植物一、转基因植物1、受体受体材料的选择（1）叶盘:从幼嫩新鲜的植物叶片上用打孔器取下直径约5mm的圆形叶片（叶盘）作为外源DNA的转入受体。（2）原生质体:无细胞壁易于接受外源基因，同时细胞璧再生后可以再生完整植株。一、转基因植物（3）悬浮细胞:单个细胞易于操作，性状稳定。（4）愈伤组织:属于分生细胞，易于接受外源基因。（5）胚状体:胚状体起源于单细胞，嵌合现象不易发生。一、转基因植物（6）活体:在植株上形成新鲜伤口，接种根癌农杆菌转化载体，得到再生芽。（7）胚轴、茎尖、茎段等也可以作为转化受体。一、转基因植物2、载体载体：是目的基因的运输工具，它能将分离克隆得到的目的基因导入植物细胞并使其整合到寄主染色体组中得以表达。一、转基因植物载体种类：（1）目的基因克隆载体：目的基因克隆载体与微生物基因工程类同，通常是由多拷贝的E.coli小质粒为载体，其功能是保存和克隆目的基因。（2）中间克隆载体：中间克隆载体是由大肠杆菌质粒插入T－DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成。它是构建中间表达载体的基础质粒。（3）中间表达载体：中间表达载体是含有植物特异启动子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。（4）卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒。（5）植物基因转化载体：植物基因转化载体是最后用于目的基因导入植物细胞的载体，故亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。根据它的结构特点又可分为两种转化载体，即一元载体系统和双元载体系统。一、转基因植物目的基因基因载体重组体分切接转筛表基因工程总体技术路线转基因方法概括起来说主要有两类：第一类是外源目的DNA的直接转化。第二类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。一、转基因植物一、转基因植物转基因方法直接导入法可以采用物理或者化学方法直接将外源目的基因导人植物细胞。物理方法包括基因枪法、电击法、超声法、显微注射法和激光微束法等。化学方法包括PEG法、脂质法等。一、转基因植物基因枪法最早是由美国康奈尔大学Sanford最先提出的。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。一、转基因植物基因枪法(genegunbombardment)又称粒子轰击(particlebombardment)，高速粒子喷射技术(high-velocityparticlemicroprojection)，经过加速装置用表面附着DNA分子(含目的基因）的金属微粒轰击植物细胞，将DNA直接射入植物细胞。基因枪法基因枪法进行遗传转化的步骤：1、靶细胞或组织的预处理：渗透压调节（甘露醇、山梨醇）2、质粒DNA的提取与纯化3、微弹头的制备（质粒DNA浓度、金粉颗粒处理）4、轰击（距离、压力）5、抗性愈伤组织的诱导与筛选6、植株再生与转化体筛选DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入决定基因枪使用成功的因素第一因素是动力系统根据动力系统，基因枪分为三大类：一类是以火药爆炸力作为动力加速微弹；第二类是以电弧放电蒸发浪作为动力；第三类是以高压气体作为动力。第二因素是微弹的制备过程。用的微载体有两类：一是钨粉，另一个是金粉，直径一般为0.6－4μm。常用的将DNA包被到微载体上所用的沉淀试剂有亚精胺、氯化钙、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等。第三个因素是受体材料的选择一、转基因植物基因枪法优点：①不受受体种类限制，特别适合根瘤农杆菌不能浸染的植物②简化了质粒构建，可以用两个或两个以上的质粒进行共转化，而不需构建一个复杂的质粒③快速简便，转化率较高。化学物质诱导法化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、PLO(多聚鸟氨酸)、PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG法应用较多,效果较好。PEG是细胞融合剂，在磷酸钙、高pH条件下引起原生质细胞膜表面电荷紊乱带来通透性改变从而有助于细胞摄取外源DNA。化学物质诱导法PEG法优缺点：优点PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合转化体很少产生。缺点原生质体培养再生难度较大原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白化苗，且由于PEG法对原生质体活力有害，转化率低。应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡椒等植物的转基因植株。一、转基因植物载体介导法具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。农杆菌介导可采用“共培养法”，(见书本图10-1B)，有根癌农杆菌和发根农杆菌两种载体系统。以野生型根癌农杆菌载体系统为例：野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-800kb，其中T-DNA区为12-24kb，vir区有35kb，T-DNA上有tms、tmr和tmt三套基因，分别编码合成植物生长素、分裂素和生物碱的酶。在T-DNA两端各有一个25bp的末端重复序列LB和RB，在T-DNA的切除及整合过程中起着重要作用。载体介导法T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的染色体上并得到表达。利用这一特点，将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建根瘤农杆菌的转化载体。载体介导法根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤。Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代。Vir区（virulenceregion）：该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。载体介导法Ti质粒的基因位点及其功能区域T-DNA区（transferred-DNAregions）：T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。载体介导法农杆菌转化的方法1、共培养法：包括原生质体共培养、悬浮细胞共培养核愈伤组织共培养。农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略生理状态来源表面有伤口的外植体农杆菌的活化愈伤组织农杆菌的共培养抗性愈伤组织获得及植株再生菌种活化状态培养基成分缩短组培时间提高再生频率2N6诱导愈伤7-10dN6-BA预培养2-3d种子优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系AB-AS诱导12hAB培养基活化12hYEP平板单菌落液体MS浸泡15min无生长素N6-AS共培养3dN6-H选择培养20d抗性愈伤组织的获得及植株再生30d62d~70d12N6愈伤诱导2N6-BA预培养3N6-H选择培养优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程4植株再生载体介导法根癌农杆菌转化植物细胞的过程大致包括：1、农杆菌对植物细胞表面特定部位的识别和附着2、经敏感细胞的诱导作用，位于Ti质粒上控制T区的基因转移的Vir区基因活化并表达3、T-DNA从Ti质粒上切割下来，通过细菌和植物细胞的壁，转移并整合到植物细胞的核基因组中。载体介导法将根癌农杆菌与植物原生质体、悬浮细胞、叶盘、茎段共同培养，用根癌农杆菌含有目的基因的质粒去转化植物受体。将短暂共培养的受体洗去根癌农杆菌在含有适量抗生素的培养基上培养，筛选具有抗生素抗性标记的转化细胞，然后用特定培养基诱导这些细胞形成转基因植株。这种方法适合双子叶植物，大多数单子叶植物因为不能诱导Ti质位vir区基因表达信号分子，应用受到限制。T-DNAcontains:1)opinesysthesisgenes2)iaaM,iaaH—auxins3)iptZ--phytohormoneTiplasmid---circulardsDNAabout200kbTiplasmidofAgrobacteriumcausescrowngalltumors100多种双子叶植物！很少感染单子叶植物！载体介导法目前已经建立的Ti质粒介导方法有共整合转化、二元整合转化等。(一)Ti质粒介导的共整合转化系统将外源基因整合到修饰过的T-DNA上形成可穿梭的共整合载体，在vir基因产物作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。共整合载体和农杆菌质粒重组过程Ti质粒介导的共整合转化系统（1）将删除tms、tmr和tmt基因的T-DNA片段克隆到大肠杆菌载体质粒pBR322上（有氨苄青霉素抗性标记)（2）然后分别插人新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因(卡那霉素抗性)和根癌农杆菌筛选标记，接入外源基因，转化大肠杆菌，利用氨苄青霉素（Apr）筛选阳性克隆。Ti质粒介导的共整合转化系统（3）将重组大肠杆菌与含野生型Ti质粒的根癌农杆菌进行结合，通过同源重组，T-DNA质粒整合到Ti质粒上得到重组根癌农杆菌，利用根癌农杆菌筛选标记筛选。（4）将得到的整合型根癌农杆菌感染植物愈伤组织，携带大肠杆菌重组质粒的T-DNA便随机整合在植物细胞染色体上，采用含卡那霉素的培养基筛选出植物细胞转化子。该方法存在载体构建困难、效率低等不足。载体介导法（二)Ti质拉介导的二元整合转化系统由两个分别含有T-DNA和vir区的Ti微型质粒和辅助质粒构成，通过反式激活T-DNA转移至植物细胞基因组内。微型Ti质粒小，转移到农杆菌比较容易，载体容易构建，效率较高。这是目前T-DNA转化植物细胞比较常用的方法。Ti质拉介导的二元整合转化系统发现农杆菌是与根癌农杆菌同属的一种病原土壤杆菌，含有Ri质粒，可以诱导植物细胞产生毛状根，毛状根细胞能分化形成植株。由于Ri质粒也含有可高效整合到植物受体细胞的染色体上并得到表达的T-DNA，因此也可用作转基因植物的载体。花粉管通道法花粉管通道法又称子房注射法，是在植物授粉后，将外源DNA注人子房的胎座位置，使DNA沿着花粉管通道进入胚囊与受精卵或者胚细胞接触而达到转化目的。病毒感染法病毒可以感染植物组织，不受双子叶和单子叶限制，作为植物转荃因载体的病毒包括单链RNA病毒、单链DNA病毒和双链DNA病毒。较为成熟的是花椰菜花斑病毒（CaMV）和番茄金花叶病(TGMV)。转基因植物鉴定一般情况下，在受体细胞群中只有少部分细胞获得了外源目的基因，而目的基因被整合到受体细胞基因组并实现表达的更少。因此必须从转化体系中筛选出含有目的基因的重组体。常用方法包括:选择性培养检测、报告基因检测。转基因植物鉴定(一)选择性培养检测Ti质粒改造时插入有抗生素标记基因，例如，Cat基因可使植物细胞表现抗氯霉素，NPTII为卡那霉素抗性基因，因此可以利用抗生素标记选择转入外源基因的细胞、愈伤组织。转基因植物鉴定另外，转入Ti质粒的受体能在无激素培养基上存活，未转化的细胞则不能，因此可以用无激素的培养基培养筛选。转基因植物鉴定(二)遗传标记检测为了便于在受体中检测到载体的存在，通常选用具有特殊遗传标记的质粒。常用的遗传标记有:①葡糖苷酸酶(P-glucuronidase,GUS)基因，它可使植物细胞在5-溴-4