第18章 高效液相色谱法

第十八章高效液相色谱法highperformanceliquidchromatography；HPLC上一内容下一内容回主目录返回基本要求掌握：反相键合相色谱法的分离机制、保留行为的主要影响因素和分离条件选择；化学键合相的性质、特点和种类及使用注意事项；流动相对色谱分离的影响；HPLC中的速率理论及其对选择实验条件的指导作用；定量分析方法。熟悉:反相离子对色谱法和正相键合相色谱法及其分离条件的选择；高效液相色谱仪的部件；紫外检测器和荧光检测器的检测原理和适用范围。了解：离子、手性和亲合三种色谱法；溶剂强度和选择性；混合溶剂强度参数的计算和流动相最优化方法。上一内容下一内容回主目录返回基本内容§18.1高效液相色谱法的主要类型和原理§18.2高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择§18.3高效液相色谱仪§18.4高效液相色谱分析方法上一内容下一内容回主目录返回流动相为液体，采用高效固定相，以高压输送流动相的色谱法。引入气相色谱的塔板理论和速率理论及先进的实验技术和方法，通过改进固定相达到了高效，采用高压输送流动相，达到了高速。特点：分离效能高、分析速度快及仪器化next高效液相色谱法上一内容下一内容回主目录返回高效液相色谱法与经典液相色谱法对比经典液相色谱法高效液相色谱法（分析型）固定相一般规格特殊规格固定相粒度（μm）75~5003~20固定相粒度分布(RSD)20~30%5%柱长（cm）10~10010~30柱内径（cm）2~50.1~0.5柱入口压强（kg/cm2）0.01~120~300柱效(每米理论塔片数)10~100104~105样品用量（g）1~1010-7~10-2分析所需时间（h）1~200.05~0.5装置非仪器化仪器化上一内容下一内容回主目录返回高效液相色谱法与气相色谱法对比气相色谱（GC）高效液相色谱（HPLC）应用范围占有机物的20%占有机物的80%分离效果高更高选择性流动相是气体，只能选择固定相流动相是液体，流动相、固定相都可选择。选择性广。温度高温常温（分离效果好）灵敏度(g/ml)10-1210-9上一内容下一内容回主目录返回第一节高效液相色谱法的主要类型和原理一、基本类型吸附色谱法（adsorptionchromatographyLSC）分配色谱法（partitionchromatographyLLC）离子交换色谱(ionexchangechromatographyIEC)空间排阻色谱(stericexclusionchromatographySEC)上一内容下一内容回主目录返回主要类型化学键合相色谱法﹡（bondedphasechromatographyBPC）离子对色谱法(pairedionchromatographyPIC)离子抑制色谱法(ionsuppressionchromatographyISC)亲合色谱法(affinitychromatographyAC)手性色谱法(chiralchromatographyCC)分类固定相流动相组分流出顺序流动相极性增大适于分离物质正相色谱(NP)ＹＷＧ－ＣＮ（ＮＨ２）有机溶剂极性小的先流出tR变小分析极性大物质、糖类反相色谱（ＲＰ）ＹＷＧ－Ｃ１８（ＯＤＳ）甲醇－水、乙腈－水极性大的先流出tR变大非极性~中等极性组分（用于HPLC80%）上一内容下一内容回主目录返回疏溶剂理论疏溶剂缔合作用示意图l.键合烃基2.溶剂膜3.溶质的极性部分4.溶质的非极性部分缔和解缔和上一内容下一内容回主目录返回（1）反相离子抑制色谱•离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质pH一定的缓冲溶液•酸性物质——加入酸，如HAc，tR↑，K↑碱性物质——加入碱，如NH3·H2O，tR↑，K↑调节pH范围：2.0~8.0适用：pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物3.反相离子抑制色谱和反相离子对色谱上一内容下一内容回主目录返回(2)反相离子对色谱法适用：pH:离子对试剂种类及浓度：上一内容下一内容回主目录返回(2)反相离子对色谱法离子对试剂种类及浓度：适用：pH:上一内容下一内容回主目录返回上一内容下一内容回主目录返回第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择一、化学键合相色谱的固定相（１）液－固吸附色谱法（ＬＳＣ）固定相常用硅胶、高分子多孔微球硅胶特点表孔硅胶（ＹＢＫ）无定形全多孔硅胶（ＹＷＧ）球形全多孔硅胶（ＹＱＧ）堆积硅珠易装柱，柱效不高，柱容量小（η：１０００~５０００）柱效高，柱容量大，价廉，但要匀浆（（η：８０００~１００００）具ＹＷＧ的优点，且涡流扩散项小，渗透性好传质阻抗小，柱容量大（η800000）上一内容下一内容回主目录返回第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择一、化学键合相色谱的固定相优点：固定液不易流失，稳定（在pH2~8范围)，热稳定性好，且能用于梯度洗脱。硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯键合量评价：含碳量覆盖度封尾上一内容下一内容回主目录返回二、化学键合相色谱法的流动相要求：①与固定液不反应②对样品有良好溶解度k=1~10最佳k=2~5③与检测器匹配④粘度小、纯度高。⑤流动相使用前需用微孔滤膜滤过、脱气。上一内容下一内容回主目录返回(一）流动相对分离的影响2211-4nkkααR由填固充定质相量及决色定谱受溶剂种类(选择性)影响受溶剂配比(强度)影响上一内容下一内容回主目录返回(二)溶剂的强度和选择性•1．溶剂的极性和强度•斯奈德(Snyder)溶剂极性参数(polarityparameter)•正相色谱溶剂极性越强，洗脱能力越强，是强溶剂。•反相色谱溶剂极性越弱，洗脱能力越强，是强溶剂。强度因子S硝基甲烷二氧六环乙醇)lg()lg()lg('gggkkkp上一内容下一内容回主目录返回上一内容下一内容回主目录返回正相色谱极性参数P′反相色谱反相色谱常用溶剂的强度因子水甲醇乙腈丙酮二恶烷乙醇异丙醇四氢呋喃03.03.23.43.53.64.24.5强度因子S上一内容下一内容回主目录返回正相键合相色谱法nii'iPP1'混式中和为纯溶剂i的极性参数及该溶剂在混合溶剂中的体积分数。i'iPniiiSS1混2.混合溶剂的强度反相键合相色谱法上一内容下一内容回主目录返回原则：控制k=2~5Xe=lg(K〞g)e/Pˊ,Xd=lg(K〞g)d/Pˊ,Xn=lg(K〞g)n/Pˊ3．溶剂的选择性依据：溶剂和溶质间的作用力---选择性参数上一内容下一内容回主目录返回•处于同一组中的各溶剂的作用力类型相同，在色谱分离中具有相似的选择性，而处于不同组别的溶剂，其选择性差别较大。(三）流动相最优化方法2.14.00.30332200OHCHOHCHHHASSS375.02.3/2.133322CNCHCNCHCNCHOHOHABSSSS四面体法267.05.4/2.1THF(a)四面体内的等洗脱面ΔABC（b）等洗脱面中10个初试实验溶剂的配比（A/B/C）上一内容下一内容回主目录返回上一内容下一内容回主目录返回三、分离条件选择（一）HPLC中的速率理论（与GC对比）•GC:H=A+B/u+C·u(填充柱）•或H=B/u+C·u(毛细管柱）•HPLC:H=A+C·umDB2TDm相忽略大，流动相柱温BT上一内容下一内容回主目录返回2）涡流扩散项及其影响因素RtnHuuHmlu，但柱效，时，min/1min/1mlu选择兼顾柱效和分析时间，1）流动相流速对HPLC板高的影响dpA2dpA柱效，，nHAdp讨论上一内容下一内容回主目录返回3）传质阻抗项及其影响因素smmssmmCCCCCC柱阻但易产生气泡柱效柱效,,,,mmmDTCDTnHDnHCdpuCuCAHHPLCsmm：mpsmmDdCC2mpDdC2TDm注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗，忽略固定相的传质阻抗ωm：色谱柱及填充情况决定的因子上一内容下一内容回主目录返回涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响上一内容下一内容回主目录返回HPLC法的分离条件(1)固定相的选择：小粒度、分布均匀的球形化学键合相固定相（dp≤10μm）(2)流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速(1ml/min)的流动相——甲醇或乙腈(3)柱温的选择：一般选室温250C左右(4)洗脱方式：等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）梯度洗脱上一内容下一内容回主目录返回第三节高效液相色谱仪一、高效液相色谱仪流程图1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质)2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置上一内容下一内容回主目录返回１.输液泵:柱塞往复泵压力：20~50MPa。特点：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。上一内容下一内容回主目录返回１.输液泵:柱塞往复泵上一内容下一内容回主目录返回1.等度洗脱洗脱方式2.梯度洗脱梯度洗脱的优点：①缩短分析周期；②提高分离效果；③改善峰形，很少拖尾；④增加检测灵敏度（因峰变瘦、变高）。但有时引起基线漂移及重复性不佳是其缺点。上一内容下一内容回主目录返回两种实现梯度洗脱的装置：高压梯度和低压梯度上一内容下一内容回主目录返回二、进样系统和色谱柱（一）进样器流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：loadinjection上一内容下一内容回主目录返回(二)色谱柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(4.0mm×250mm，5μm),上一内容下一内容回主目录返回三、检测器（一）光电二极管阵列检测器（PDAD）上一内容下一内容回主目录返回二、蒸发光散射检测器(ELSD)上一内容下一内容回主目录返回第四节高效液相色谱分析方法•定性分析方法•定量分析方法：外标法、内标法同GC上一内容下一内容回主目录返回•作业：3,13,19上一内容下一内容回主目录返回三、分离条件选择（自学）（一）HPLC中的速率理论（与GC对比）•GC:H=A+B/u+C·u(填充柱）•或H=B/u+C·u(毛细管柱）•HPLC:H=A+C·umDB2TDm相忽略大，流动相柱温BT上一内容下一内容回主目录返回2）涡流扩散项及其影响因素RtnHuuHmlu，但柱效，时，min/1min/1mlu选择兼顾柱效和分析时间，1）流动相流速对HPLC板高的影dpA2dpA柱效，，nHAdp讨论上一内容下一内容回主目录返回3）传质阻抗项及其影响因素smmssmmCCCCCC柱阻但易产生气泡柱效柱效,,,,mmmDTCDTnHDnHCdpuCuCAHHPLCsmm：mpsmmDdCC2mpDdC2TDm注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗，忽略固定相的传质阻抗ωm：色谱柱及填充情况决定的因子上一内容下一内容回主目录返回涡流扩散与各种传质阻抗对液相色谱峰展宽的影响上一内容下一内容回主目录返回HPLC法的分离条件(1)固定相的选择：小粒度、分布均匀的球形化学键合相固定相（dp≤10μm）(2)流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速(1ml/min)的