细胞形态结构观察

第三章细胞形态结构观察技术一、活体细胞的观察和摄影技术1.倒置显微镜：P60图3-3（提问光镜使用注意）适用：观察贴壁生长的培养中细胞构造特点：因物镜置于观察标本下方而得名技巧：调弱光亮度，集光器稍远些，增大光线反差，对正光轴；摄影时，使观察物稍偏远离焦点，照片会更清晰。底片选用正片，反差大2.相差显微镜P62图3-4适用：可增强活细胞同背底反差，帮助看清细胞的轮廓和细胞内细微结构，如：核仁、染色质、线粒体等。构造特点：有两个附加构件：相差接物镜：其光学系统中有一个光环透镜相差聚光器：内有数个相位板，使用时与物镜倍数一致技巧：细胞培养瓶质地均匀透明较好，最好用塑料瓶；观察摄影时，瓶壁要擦净；光轴对正，照明度适宜，摸索试调至最佳3.荧光显微镜P67图3-6适用：观察细胞内天然的荧光物质，如维生素、脂褐素、核黄素等，也可观察可与荧光染料结合的细胞组分。构造特点：与普通光镜比，区别在于用高压汞灯光源，波长可激发荧光物质产生荧光；滤光片不同。技巧：观察必须是自发荧光或经荧光染色的标本；选用效果最好的滤光片；荧光标本易褪色，不能长期保存，观察操作要迅速，作好记录；仪器的高压汞灯光源启动后15分钟内不得关闭，关闭后，灯冷却后方可再起动，否则寿命大减，长时间观察标本时，需带护目镜。4.暗视野显微镜P64图3-5适用：观察记录活细胞或细胞器的运动轨迹，提高分辨率构造特点：只有聚光器不同于普通显微镜，设有一个中央遮光板使照明光线不能直射。标本进入目镜，只许标本散射光进入目镜技巧：物镜的数值孔径必小于聚光器的数值孔径；盖玻片，载玻片应清洁无痕；聚光镜和载玻片之间加香柏油，保证效果。二.显微摄影技术p681.概念：显微摄影术是利用显微摄影装置拍摄显微镜视野的物象的技术。2.技术类型：胶片相机摄像数码相机摄像CCD图像采集三者前期操作一致，但成像和图像存储原理不同。3.图像记录原理：胶片相机摄像：显微摄影时，光线自标本片的微小物件射入物镜后，造成一个倒立的放大实像，经目镜进一步放大后，投射在照相底片上，使底片感光而记录下显微镜视野下物象。数码相机摄像：是以数字的形式用电子设备储存图像。拍照后，可通过数据线将所拍摄图像传输到电脑，也可将相机的存储卡取出，通过读卡器将拍摄的图像传输到电脑上。数码相机摄像原理与CCD图像采集器相同。CCD图像传感器：即CCD(chargecopledDevice,感光耦合组件）CCD的组成结构有三个层次：上层：聚光镜片（增光镜片）中层：一个类似马赛克的网络（分色网络）下层：垫在下层的电子线路矩阵（感应线路是可记录光线变化的半导体）CCD工作方式之一：当数码相机的快门开启，来自影像的光线穿过，这些马赛克会让感光点的=氧化硅材料释放出电子（正电）与电洞（负电）。经由外部加入电压，这些电子和电洞会被转移到不同极性的另一个硅区暂存。电子数的多寡和曝光点所接受的光量成正比。在一个影像最明亮部位，可有十万电子被积存起来。CCDIMAGESENSOR外形彩色CCD的组成结构分图CCD的三层结构：上：增光镜片、中：色块网格下：感应线路由微型镜头、马赛克分色网格，及垫于最底层的电子线路矩阵所组成4.拍摄技术步骤：胶片相机拍摄：p69-74(生物教研室李相伟）数码相机拍摄：p74-75(同上）CCD图像采集：（病理教研室姚海涛（实验中心刘君星）5.缩时显微摄影术适用：记录细胞或细胞器连续动态变化过程正常时态连续拍照缩时逐格拍照主要装备：倒置显微镜，16mm摄影机，自控缩时启动拍摄装置。原理：缩时间隔时间：目标物实际活动时间X1/24影片排成后要求放镜时间=3600秒／10秒x1／24=15秒所以，每隔15秒摄取1张照片。三、光镜下的固定细胞观察法（组胚，病理）细胞器培养皿内铺盖片单层培养取盖片细胞悬液离心沉淀涂片固定染色观察拍照（固定剂，染色剂知识介绍）固定剂的作用：穿透，固定，保形，防腐固定剂的选择：P83细胞内组分的差异染色。染色剂的选择：Giemsa—染色体桃红色。本书P84Feulgen—DNA紫红色，细胞质绿色。鄂P141吖啶橙—RNA红色，DNA亮绿色。本书P86苏木精-伊红（HE)—细胞核蓝色，细胞质红色本书P85过碘酸席夫—细胞内含糖原区—紫红色。章P58苏丹红III—细胞内含脂肪区—橘红色。章P59鬼笔环肽—溦丝染色。章P59免疫荧光法—溦管染色。章P60联苯胺+H2O2—过氧化氢体染色。小章P37詹纳斯绿B—活体细胞线粒体。小章P43四、激光扫描共聚焦显微镜技术（实验中心）1.概念和原理P76lasterscanningconfocalmicroscopeLSCM激光共聚焦显微镜是20世纪80年代以来发展起来的一项细胞生物学和高分子材料科学领域的高科技分析仪器。其在传统光学显微镜基础上，利用激光作为光源，经照明针孔可形成点光源照射荧光样品，所产生的激发光斑被探测器针孔以共轭的形式接收于同一焦平面上，可通过计算机控制显微镜移动，以实现在同一焦平面（x-y)上的逐点扫描。计算机以像点的方式在计算机屏幕上形成图像。同时，也可沿z轴方向逐渐改变焦平面，完成对样品厚片不同层面的扫描，进行类似CT断层扫描的无损伤连续光学切片，经计算机三维重建处理，可形成观察标本的三维结构图形。2.LSCM的主要组成部分及工作原理①激光光源:氢离子激光,能同时/顺序/分别输出紫外光和可见光②照明针孔:使激光通过照明针孔后形成点光源,点光源具有方向性强,发散小、亮度高等优点③光束分离器：可将样品经点光源照射所激发的荧光与其它非信号光线分开，排除非信号光线干扰，提高分辨率和清晰度。④物镜⑤焦平面：激光点光源照射标本样品，激发样品发射荧光，形成焦点光斑，在焦平面处聚焦成像。⑥探测器针孔：起到空间滤波器作用。阻断非聚焦平面散色光和焦平面上非焦点光斑散色光。保证样品所衍射的聚焦光斑和探测器针孔的成像光斑，包含相同信息。（两点共扼聚焦）⑦光电倍增器：接受通过探测器针孔的光信号，转换成电信号后转输至计算机，在屏幕上形成焦平面图形⑧多荧光通道:可以同时对样品进行多种荧光标记的信号检测⑨计算机控制系统：控制步动电动机带动显微镜移动，实现在同一焦面(x-y轴)上逐点扫描；控制共聚焦系统；控制沿z轴改变焦平面，进行对样品厚度的连续光学切片和对样品结构的三维重建；控制信号的采集、转输、分析。3.LSCM相对光学显微镜的优点①LSCM的图像是以电信号形式记录下来的，可用电子计算机技术模拟数字化处理②利用共聚焦系统有效排除了焦点外信号干扰，不仅提高了x-y轴焦平面分辨率和清晰度，而且可对观察样品进行z轴无损伤光切片，实现三维结构的定位成像③可广泛应用于活细胞的形态、结构，定量、定性、定位分析。与荧光探针技术结合，可进行单细胞分选和多种细胞分子生物学研究及细胞机能学研究4.LSCM的应用①贴壁细胞的分选数量较多细胞群的分选:在特别培养皿上一类细胞群经荧光染色，另一类细胞群未经染色，可用高能激光把荧光染色的细胞群杀死，而另一类保存，可继续培养。少量或单克隆细胞的分选：对于选中的突变细胞、杂交细胞或肿瘤转移细胞，可利用铺有特制膜的培养皿上，在选中的细胞克隆周围切割成八角带，再用高能激光杀伤八角带之外的细胞。②细胞形态学研究：可行X-Y焦平面形态研究，尤其是可行工z轴三维形态结构研究。可对细胞形状，周长，面积，平均荧光强度，也可对细胞内溶酶体，线粒体，内质网，细胞骨架，结构性蛋白形态、数量、位置的描述。③细胞内某些大分子组分分析：与免疫荧光技术和荧光探针技术相结合，可对细胞内蛋白、DNA、RNA、酶、受体等组份进行定性定量定时定位分析，以及细胞内PH和细胞内某些离子进行分析。用于细胞机能学研究。细胞通讯研究。④细胞机能学研究及细胞通讯研究⑤细胞显微外科手术：在LSCM镜下可将激光作光子刀使用进行细胞穿孔、染色体精切，细胞器烧灼，神经元突触切除，细胞器转移等手术。五、电镜观察法P78分辨率：肉眼0.1mm光镜（油镜）0.2um电镜可达0.08nm培养细胞的电镜观察途径透射电镜观察内部结构原位切片组织消化分离后切扫描电镜观察c表面结构原位扫描观察消化分离观察锇酸固定剂的发现：锇酸用量很少，但代价昂贵，事先同电镜室商量。（研究生课程专设有电镜课）用途：观察细胞的亚微结构，进行生理、药理、病理学研究。如：核糖体分布与脱粒线粒体变形溶酶体异常细胞膜表面结构和吞饮作用，微绒毛变异细胞骨架紊乱精子结构异常（见P82电镜照片）