有毒中药现代药理研究之附子

附子[基原]本品为毛其科乌头屑植物乌头Af。nj6Mmf“rMifAd?jjDebn的子根加工品。[化学成分]含多种生物碱，总含量为o．32％，主要为海帕乌头碱(次乌头碱，hypa凹n心ne，C：：Hdsol。N)约0．048％、乌头碱(aconNne，CMHM0llN)0．01％、新乌头碱(meeacont—tine，CMHM01，H)0．006％，其次有塔拉地萨敏(tal饥t2amine，C：dH：，OsN)、川乌头碱甲(chuanwubase，C2：HMO。N)、J1[乌头碱乙(chuanwub69eB．CMHM0‘N)、尼奥灵(neo—1ine)、宋果灵(son80rine)、附子灵(fuz山ne)、北乌碱(beiw山tne)、单乙酰塔拉胺(mono—acctytalatisamtne)、乌头生布碱A、B(senbusineA，B)、去甲猪毛菜碱(sals01inot)、棍掌碱(cogyneine)、借碱(18narine)、禾布碱(hokbusiMe)A，D、杰沙乌头碱(jesaconitiRe)、苯甲酰乌头原碱(ben加1aconine)、苯甲酰乌头原碱(benz。ylme：acon5ne)、苯甲酰下乌头碱(ben301hypaconine)[1d。从日本产附于中分离出消旋去甲乌药碱(d1—demethylcoclaMrtne，N8enamine)和棍*碱(c。rynetne)，前者为水涪性强心有效成分，后者早期呈明显升压作用。所含去甲猪毛菜碱也为水镕性强心成分。四川江油一带产附子生物碱含量一船在I．1％一1．3％，而自四川江彰移栽于南京的附子中含总生物碱约o．77％，主要为新乌头碱(mesaconitine)约o．4％，另有海帕乌头碱，微量的川乌头碱甲及乌头碱，从附子中还分离到4种鸟头聚糖A、B、C、D(acon地nA，B，CPD)．水涪性成分尿喀咬，以及消旋去甲乌药碱(ht6enamLne)。此外，生附子尚含类脂成分约o．7％，其中附于脂酸(AD‘’二十碳双烯酸)含量最多，尚有附子磷脂酸钙、9—谷笆酪及少量P—谷笆碎脂肪酸脂等。附子经炮制加工后，生物碱含量降低。盐附子含醚溶性生物碱o．15％，氯化物30％；黑附片及白附片含醚活性生物碱0．05％。[含量测定]一、总生物碱及乌头碱的溯定(一)酸碱淌定法药材加氨水及乙醚后振摇，再加少量水放置后滤过，滤液蒸发后至于，加入95％乙醇加热后加水，再加入甲基红和亚甲兰指示剂，用o．1m01／L盐酸滴定至粉红至紫罗兰色。(二)电流滴定法取总生物碱提取液，以L6m01／1‘盐酸溶液为支持电解质，用电流淌定法进行测定。滴汞电极为指示电极，汞淌周期约2—3秒，甘汞电极为参比电极，在一o．6v(对饱和甘汞电极)用硅钨酸标准液或四苯硼铀标推滴定，以乌头碱计算含量。(三)非水滴定法生药样品用氨水碱化后以乙醇提取，醚液再以o．125m01儿硫酸萃取。酸液碱化后用氯仿萃取，蒸去氯仿，以乙醇溶解，再获去乙醇，残谊溶于酷酐中，以甲紫为指示剂，用o．1m01儿高氯酸标推液滴定G(四)比色法1．雷氏盐法用氨水碱化后，用乙醚—氯仿(3；1)提取，再用o．05m01儿硫酸液萃取上述提取液。硫酸萃取液以2．5％雷氏盐溶液沉淀。滤过，沉淀溶于丙田中，于520nm比色测定。2．甲橙比色法生药样品加甲橙酷酸—醋酸铵缓冲液振格50min后加入氯仿振摇，取下层氯仿提取液，脱水，于4l2nm测定。(五)薄层色谱(纸色谱)一紫外分光光度法1．样品加入碱性氧化铝研磨后依次加入乙醚—氯仿(2：1)和氨水溶液振荡提取。取硅摄十G薄层板用氮仿—异丙碎(3，1)展开一次．取出后点样于此薄层板上，再用异丙醇—甲酪—23％氨水(36；24：1)于30℃展开。以o．01m01儿碘溶液显色后刮下乌头碱，残谊用1％盐酸溶解，于234nm波长处检测。2．生药以氨水湿润后用乙醚—氯仿(3，U提取。点样于层析滤纸上，用正丁醇—冰酷酸—水(411，5)展开．剪下相应斑点后用1m01儿盐酸铣脱，于265—295nm范围内6gd定*3．取1％盐酸处理过的滤纸，洗去氯离子，干燥。点样，用戊醉—25％甲酸—苯(24，25，3)展开，碘化铰钾显色，剪下相应于乌头碱的部位，以1％盐酸液洗脱，在232—234nmllU定。4．样品加入氧化铝、氨水液及乙醚—氮仿(2，1)提取，点祥于硅胶G板上，用异丙醇—甲醇一25％氨水(36；24；1)展开，碘蒸气显色，于228—235nm6gd定。L取药材加氨水及氯仿后，放置过夜，冉加入西贡胶粉，混均匀，放置。加水于温合物中，分出氯仿层，蒸于后以氯仿定容。取层析滤纸，分别在9—14cm和19—24cm处涂布pH7．o和pH3．o的磷酸氢二钠—柠核缓冲液，干燥后备用。点样于上述层析随纸上，以苯—石油醚(5‘1)室温上行展开。将展开后的层析滤纸于254nm紫外灯下观察，划出pH3．o区域的蓝色荧光带，以95％乙醇在55—60℃提取，23lnm6gd定。二、单一生物窿的剩定(一)薄层色谱法1．乌头碱和下乌头窿的测定将样品以25％氨水碱化后用乙醚—氮仿(3；提取液脱水后蒸干，以氮仿定容。将样品液点子硅胶GFzid板上，用氮仿—乙醚〔1开，紫外灯下定位。扫描测定波长ks＝240nm，kR＝400nM。2．生药乌头窿、中乌头碱和次乌头碱的测定将样品以氨水碱化后，用乙醚提取．蒸于提取液中的乙醚，残渣以二氯甲烷溶解后定容。将提取液及标准品溶液点于薄层板上，用环己烷—乙酸乙6—二乙胺(8“1‘1)展开，紫外灯下定位。扫描澜定波长As＝236nm，kB＝350nm。另外有人用同样的提取条件和扫描条件测定印鸟窿、腰花乌头碱和塔拉乌头碱的含量。3．滇乌碱和塔拉乌头肪的1gd定样品同上处理，然后将样品提取液及标准品溶液点于高效硅胶GF2”板上，展开后扫脑测定。上述二种生物碱分别在270nm和236nm处有最大吸收，二者均在350nm有最小吸收。(二)用Chromatotron仪分离双花类生物碱应用离心加速径向薄层色谱仪分离了下列生物碱；乌头碱、3—去氧乌头碱与美沙乌头窿，斯塔飞燕草碱与s、apNdine，硬飞燕草碱与14—乙酰硬飞颓草窿，c2。二花生物碱维持钦与加山英碱。(三)高效液相色谱法1．以甲醇—水—氮仿—三乙胺为流动相样品以10％氨水碱化后用乙醚提取，蒸子乙醚提取液，残渣加少量甲醇溶解，加人内标溶液(o．2m8／m1甲基荣的甲酪溶液)，定容。色谱条件：YwG—C18H35柱，甲醇—水—氯仿—三乙胺(70，30；2‘o．1)为流动相，240nm检阅。可用于中乌头窿、乌头碱及次乌头碱的测定。2．以o．05m01／L磷酸盐缓冲浪—四氢映喃为流动相以填充TSKGelLS410()DSsil(5y”)的不锈钢柱为色谱柱，o．05m01儿磷酸盐缓冲浪(pH2．7)—四氮映喃(89，11)为流动相，在254nm波长处枪1gd。另外一种方法是基于用含有o．01m。1儿己烷磺酸铀的磷酸盐缓冲液(pH2．7)—四氢映喃(17：3)混合液的离子对色谱法。上述方法用于乌头碱和苯甲歌乌头原碱的测定。3．以碳酸铵—THF为流动相用Res。1ve0阳硅胶柱及下列不同比例的流动相分离C1旷二菇生物碱类：以1．7mm01儿碳酸铵—THF(1：1)分离3—乙酰基乌头碱、乌头碱、美沙乌头窿、脱氧乌头碱、l4—苯甲酰基—8—cL甲基乌头脑、苯甲氧基乌头胺和飞燕草窿6以1。8mM碳酸铰—THF(1：2)分离滇乌碱、cra55icaullneA、crasIicautine、50resoanLtin6和crassicaMsine3以0．9mm01儿碳酸铵—THF(3；1)分离o朋nNne和N—乙歌基—N—去乙基乌头碱3以1．8mm。l儿碳酸铵—THF(1；1)从falconertne中分离falconerineacetate。[炮制研究]一、产地加工与蛔触的研究附子由于毒性强，古今都很重视附子加工炮制，自清代至今主要是用盐水胰的方法，在盐水中长时间的浸泡，可使有毒的乌头碱等溶于水中或水解，虽然径的时间长，但盐的浓度高，故不会腐烂。这样的加工，对降低附子毒性，保证用药安全确有好处。附子在产地已经净洗、泡蛆(蛆水泡)、煮、剥皮、切片、漂片(水漂洗)、蒸片、烤片等加工处理，使其毒性降低*据报道，四川产的生附于生物碱含量为1．川，炮制成的白附片含量为o．17％，熟片为o．21％，黑片为o．27％，挂片为o．13％，黄片为o．30％，盐附子为1．34％。附子在炮制生产过程中，生物碱的减少主要在泡姐(损失31．6％)，漂片(损失3L5％)．冰附(损失16．1％)，生物碱减少总量达81．30％。有人通过用家兔进行实验，观察制附于、附于生物碱部分及非生物碱部分对动物心电固的影响。结果表明，口服制附于及非生物碱部分，其心电团无任何异常表现，但服用生物碱制剂虽剂量很小，其心电图捡查可以发现传导紊乱，由于心脏传导抑制产生室性颧动而动物迅速死亡，经离体心脏实验又观察到非生物碱部分有强心作用，能使心脏搏动加强。可见中医以炮制后的附子用于回阳救逆IM真元是有道理的。国外有人用乌头、附于的各种提取部分对瞻踪及琢鼠的离体心脏进行实验，结果观察到其生物碱的租碱基部分，作用与乌头碱相类似，能引起心脏的传导障碍。此部分加水加热很快分解，所得分解物质毒性减弱。附子的中性物质、氯仿不镕物、甲醉提取后的残渲部分有强心作用，实验剂量无毒性，加热后其作用不减弱。传统以朋巴水炮制后供药用，后改用饱和食盐水炮制的附于，从外观、总生物碱含量、组分层析、毒性等方面与传统炮制的附子进行比较，认为食盐代替蚁巴炮制是可行的，且附子采用单纯加热处理，也可以降低毒性并保留疗效。又据文献报道，在反复试验过程中，逐渐体会到用盐量愈少，鸟头碱转化越快，越充分；少泡水有效成分流失也就越少，苦味随着少僳水而增加，麻味随着少用盐而减少。所以采用一次蒸鲜附子8h，获得成功。这样蒸出的附于，其味极苦后味微有回味，庶昧极少，甚至不麻，其色桶红，无任何毒性反应。本品总检含量以“乌头碱”计算为o．83％，LDs。在1008／k8以lL“。以上研究成果均说明附子经产地加工后，毒性可以降低，但也有文献对产地盐制附于提出异议，经测定附子产地盐制加工后，作为有效成分之一的生物碱要损失93％。另外，在产地加工中16于浸泡时间、温度、煎煮时间和温度不同，制附子成分的含量相差10倍。这样反而易造成临床上用量不淮而发生事故。因此建议肘子在产地不必进行如此繁复的加工，只需在产地用盐水煮至远心晒干。这样加工好处很多：淀粉糊化，干后药材角质化，易保存而避免了生附于粉性强，易虫蛀之弊；有效成分得以保存，可减少用药量，节约药材，且由于成分含量差异不大，利于医生掌握剂量，省工、省时，降低了成本；制出的附于可灵活运用，既可当生附于按张仲景原意使用，又可以按有关要求进一步加工成炮、炒、酷制附子应用。但当生附子用时应强调先煎，煎煮时间不应少于2h，以降低附于毒性，防止中毒。对于附子的煎煮也有文献提出新法，将附于捣为小于玉米粒的颗粒，开水煎煮10min后，尝之已无麻味．服之末见中毒，安全可靠。附于毒性大小与产地、品种、炮制方法有关，川附子只须先煎煮10—15min，丽江附于先煮15—20mZn，保山附于须先煎煮20一25min，再与其他药物混合煮5—10min即可服用。日本人高桥真太即提出以110—115℃(1．5k8ycm2)对附于作高温高压处理40min，既可达到破坏酯铿、降低毒性的目的，又避免了生物碱的大量流失。另外，对于盐漂后附于的炮制，有人主张采用城灰火炮惧附子，烃附于经漂、根、姜汁制后，毒性小，副作用少，其性温和，有回阳救逆、益气固脱，补精髓，温肾阳，补脑化虚痰的作gL“i。二、炮制的化学研究由于附子生物碱含量及组成个同，其毒性差别很大，为厂保证临床用药安全，十分需要了解炮制前后肘子中生物碱组成的变化。作为生药饱制的化学研究一环，日本北川勋等对各种附子所台的成分傲了比较研究，其利用高效液相色谱法测定了各种附子的市售品、含附子的双方方剂中乌头碱型生物碱的含量，对15种市售品附子所含