酶工程复习资料

酶工程第一章绪论1.何谓酶工程，试述其主要内容和任务。答：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。2.酶有哪些显著地催化特性。答：专一性强催化效率高条件温和3.试述酶工程的发展概况与前景。答：发展概况：1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶，开创了酶技术走向商业化的先例。1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，用于皮革的软化及洗涤。1908年，法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶，用于纺织品的褪浆。1911年，Warlerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清。1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。1960年，法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量。20世纪80年代迅速发展起来的动、植物细胞培养技术，继微生物发酵生产酶之后，已成为酶生产的又一种途径。前景：经过100多年的发展，酶工程已经成为生物工程的主要内容，在世界科技和经济的发展中起着重要作用。今后将以更快的速度向纵深发展，显出广阔而诱人的前景。4.终止酶反应的方法：（1）反应时间一到，立即取出适量反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活；（2）加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活；（3）加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离催化反应的最适pH，而使反应终止；（4）将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至10℃以下，而终止反应。5..P酶和R酶的分类和命名有何异同？答：主要由蛋白质组成——蛋白类酶（P酶）;主要由核糖核酸组成——核酸类酶（R酶）。P酶的分类原则：a按照酶催化作用的类型，将蛋白质酶类分为六大类。b每个大类中，按照酶的作用底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类。c每一亚类中再分为若干小类d每一小类中包含若干具体的酶。命名：根据系统命名法，每一种具体的酶，除了有一个系统名称以外，还有一个系统编号。系统编号采用四码编码方法。第一个号码表示该酶属于6大类酶中的某一类，第二个号码表示该酶属于该大类某一亚类，第三个号码表示亚类中的某一个小类，第四个号码表示这一具体的酶在该小类中的序号。R酶的分类原则：a根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是其他分子，可以将R酶分为内催化和分子间催化两大类。b在每个大类中，根据酶的催化类型不同，将R酶分为若干亚类。c在每个亚类中，根据酶的结构特点和催化特性的不同，分为若干小类。d在每一小类中包含若干具体的酶。6.名词解释：酶活力：指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。酶活力单位：在特定条件下，每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位（IU）酶比活力：指在特定条件下，每1mg酶蛋白所具有的酶活力单位数，是酶制剂纯度的指标。7.汇集⑴1926年，萨姆纳首次从刀豆提取液中分离纯化得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质性质。⑵影响酶催化的各种因素：酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。⑶【酶活力的测定方法：化学测定法，光学测定法，气体测定法】⑷酶的转换数Kp，又称摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。是酶催化效率的一个指标。通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示。单位为min-1。一般酶的转换数在103min-1左右。⑸酶的生产方法：提取分离法，生物合成法和化学合成法。⑹两种酶活力单位之间可以互相换算。即：1Kat=1mol/s=60mol/min=60×106μmol/min=6×107IU⑺酶主要的提取方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。⑻生物合成法可以分为微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶和动物细胞培养产酶。⑼第二章微生物发酵产酶1．试述酶生物合成的基本过程。答：(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制。。(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌。(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中。(4)接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物。(5)将产物抽提并进行精制。(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水。2.何谓酶生物合成的诱导作用？简述其原理。答：加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用，简称诱导作用。原理：当培养基中以乳糖为惟一碳源时，细胞吸收乳糖为别乳糖。别乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的结构发生改变，从而使它与操纵基因的结合力减弱，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，就使RNA聚合酶可以与启动基因结合，进行转录而合成结构基因所对应的酶。3.什么是酶生物合成的反馈阻遏作用？简述其原理。答：酶生物合成的反馈阻遏作用又称为产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。原理：当环境中色氨酸浓度增加，阻遏物达到一定程度时，阻遏蛋白与阻遏物结合，使其结构发生改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因的结合力增强。阻遏蛋白与操纵基因结合，就排挤RNA聚合物与启动基因的结合，使转录无法进行，酶的生物合成因此受到阻遏。4.简述分解代谢物阻遏作用的原理和解除方法。答：1.分解代谢物阻遏作用的原理：分解代谢物阻遏涉及一种激活蛋白对转录作用的调控。分解代谢物阻遏中，只有当一种称为分解物激活蛋白(CAP)首先结合到启动子上游后，RNA聚合酶才能与启动基因结合。这种激活蛋白是一种变构蛋白，当它与cAMP结合后构象发生变化，这时才能与DNA结合并促进RNA聚合酶的结合。无论在原核生物或高等生物中cAMP都是多种调控系统的重要因素。cAMP由腺苷酸环化酶催化ATP而产生，葡萄糖能抑制cAMP形成并促进cAMP分泌到胞外。葡萄糖进入细胞后，胞内的cAMP水平下降，RNA聚合酶不能与启动子结合。因此，分解代谢物阻遏实际上是cAMP缺少的结果。2、解除方法如果在培养基中补充cAMP，上述阻遏现象可以被抵消。5.酶的生物合成有哪几种模式及主要影响因素？？答：（1）同步合成型：该类型酶的生物合成速度与细胞生长紧密联系。（2）延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后酶可以继续合成一段较长时间。（3）中期合成型：在细胞生长一段时间以后才开始合成，而在细胞生长进入平和期后酶的合成也随之停止。（4）滞后合成型：细胞生长一段时间或者进入平和期以后才开始起生物合成并大量积累。主要影响因素是酶对应的mRNA的稳定性及培养基中阻遏物的存在情况是影响酶生物合成的主要因素。6.如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？答：发酵过程中，为了能对生产过程进行必要的控制，需要对有关工艺参数进行定期取样测定或进行连续测量。参数中，对发酵过程影响较大的有温度、ＰＨ、溶解氧浓度等。(1)温度：温度对发酵的影响是多方面的，主要表现在对细胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成方面。例如：枯草杆菌的最适温度为34--37℃，黑曲霉的最适温度为28--32℃。(2)pH：发酵过程中pH的变化取决于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。微生物生长和生物合成都有其最适和能够耐受的pH范围，大多数微生物生长的最适pH6.3-7.5，霉菌和酵母生长的最适pH4-6，放线菌生长的最适pH7-8。(3)溶解氧浓度：对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。好氧性微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。【（1）细胞活化与扩大培养；（2）培养基的配制；（3）pH的调节控制；（4）温度的调节控制；（5）溶解氧的调节控制：1）调节通气量2）调节氧分压3）调节气液接触时间4）调节气液接触面积5）改变培养液性质】7.提高酶产量的措施主要有哪些？答：选育优良的产酶细胞、添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂和添加产酶促进剂等。8.简述固定化微生物细胞发酵产酶的特点。答：①提高产酶率②可以反复使用或连续使用较长时间③基因工程菌的质粒稳定，不易丢失④发酵稳定性好⑤缩短发酵周期，提高设备利用率⑥产品容易分离纯化⑦适用于胞外酶等胞外产物的生产9，固定化微生物原生质体发酵产酶有何特点？答：①变胞内产物为胞外产物②提高产酶率③稳定性较好④易于分离纯化10.名词解释；组成型酶：有的酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大，这类酶称为组成型酶。适应型酶：有些酶在细胞中的含量却变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响，这类酶称为适应型酶。诱导作用：加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用，简称诱导作用。操纵子：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。11.产酶微生物的特点？答：⑴酶的产量高⑵容易培养和管理⑶产酶稳定性好⑷利于酶的分离纯化⑸安全可靠，无毒性第四章酶的提取与分离纯化1.细胞破碎的方法主要有哪些？各有何特点？答：细胞破碎的方法可以分为：机械破碎法（包括捣碎法，研磨法，匀浆法）；物理破碎法（包括温度差破碎法，压力差破碎法，超声波破碎法）；化学破碎法（包括添加有机溶剂，添加表面活性剂）；酶促破碎法（包括自溶法，外加酶制剂）特点：机械破碎法：处理量大，破碎效率高，速度快。物理破碎法：处理条件比较温和，有利于目标产物的高活力释放回收，但破碎效率低，产物释放速度快，处理时间长，不适合大规模细胞破碎的需要。多局限于实验室规模的小批量使用。化学破碎法：优点：比机械破碎法的选择性高，胞内产物总释放率低，料液黏度小，有利于后处理。缺点：通透性差，时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过5%，有些化学试剂有毒。酶促破碎法：优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。2.试述酶提取的主要方法。答：酶提取：又称酶的抽取，是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。方法：盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶剂提取。3.简述酶沉淀分离方法的原理与特点。（1）盐析沉淀法分离原理：利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离。特点：不同浓度的蛋白质浓度产生沉淀所要求的临界浓度不同；蛋白质浓度大时，中性盐极限沉淀低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量减少，蛋白质溶解损失小；蛋白质浓度低时相反，中性盐极限沉淀高，共沉作用弱，分辨率高，但用盐量增大，蛋白质回收率低。（2）等电点沉淀法分离原理：利用两性电解质在等电点是溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特点，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。特点：在溶液的pH等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来；由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定的溶解性，而使沉淀不完全；在实际使用时，等电点沉淀法往往与其他方法一起使用；有时单独使用等电点沉淀法主要是用于粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。（3）有机溶剂沉淀法分离原理：利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。特点：一般比盐析法析出的沉淀易于离心或过滤分离，不含无机盐，分辨率也比较高；但是有机溶剂沉淀法容易引起酶的变性失活，所以必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。（4）复合沉淀法分离原理：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离。（5）选择性变性沉淀法分离原理：选