西番莲果皮总黄酮提取工艺及抑制亚硝化反应_冯纪南

第30卷,第3期光　谱　实　验　室Vol.30,No.32013年5月ChineseJournalofSpectroscopyLaboratoryMay,2013西番莲果皮总黄酮提取工艺及抑制亚硝化反应①①湖南省自然科学基金项目(12JJ3019);湖南省科技厅计划项目(2010GK3123;2011FJ3167);湖南省教育厅重点科研基金项目(10A113);郴州市科技计划项目(郴财教指[2011]53号)②联系人,电话:[phone];传真:[phone];E-mail:[e-mail]作者简介:冯纪南(1958—),女,湖南省郴州市人,副教授,主要从事天然产物有效成分分离研究工作。收稿日期:2012-08-07;接受日期:2012-08-28冯纪南　黄海英a　赵丽萍　章爱华b　邓斌②(湘南学院化学与生命科学系　湖南省郴州市苏仙北路8号　423000)a(湘南学院教务处　湖南省郴州市苏仙北路8号　423000)b(吉首大学化学化工学院　湖南吉首市人民南路120号　416000)　　运用正交试验设计探讨了西番莲果皮总黄酮的微波辅助提取工艺条件,并采用分光光度法研究了提取液对合成亚硝胺的抑制能力和清除亚硝酸盐的能力。结果表明,西番莲果皮总黄酮提取的最佳工艺参数:乙醇体积分数60%、料液比1∶40(g/mL)、微波辐射时间15min、微波炉功率400W,在此条件下总黄酮的提取率为57.03mg/g。对西番莲果皮总黄酮提取液的抑制亚硝化反应研究表明,提取液对亚硝胺合成的最大阻断率为80.8%,对亚硝酸钠的最大清除率为73%。　西番莲果皮;总黄酮;微波辅助提取;亚硝酸盐;阻断;清除:O623.54;O657.32　　　:A　　　:1004-8138(2013)03-1179-061　引言西番莲(Passifloraedulis)俗称鸡蛋果、百香果,属西番莲科,西番莲属植物,热带多年生草质至半木质藤本攀附果树,原产澳大利亚和巴西,现广泛分布于热带和亚热带地区,我国的台湾、广东、福建、海南等地种植西番莲已有很长的历史[1]。前期研究表明,西番莲果皮中含有果胶、黄酮、生物碱、多糖、多酚类物质等药用成分,其中,鞣质与黄酮类成分含量较高[2]。国内外学者对西番莲果皮的研究多为对其果胶的提取[3],对西番莲果皮中黄酮类化合物的研究极少报道。现代药理研究表明黄酮类化合物具有多种生物活性,具有抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力等药理作用[4]。目前癌症已成为威胁人类生命的最大杀手,其中亚硝胺化合物是当前最令人关注的化学致癌物之一。从防癌角度出发,采用阻断亚硝胺合成或清除合成的亚硝胺前体是防治癌症的有效途径之一[5,6]。而流行病学及大量动物实验证实,植物中的黄酮类物质能起到阻断亚硝胺合成或清除亚硝酸根的作用,从而达到预防癌症发生的效果[7]。本研究以此为出发点,探讨西番莲果皮中总黄酮微波辅助提取法的优化条件,同时在模拟人体胃液的条件下,研究西番莲果皮提取物阻断亚硝胺合成以及消除亚硝酸盐的效果,以期为西番莲果皮保健食品的进一步开发利用提供科学依据。2　实验部分2.1　西番莲果皮,购于广西柳州明朝饮料有限公司,用蒸馏水清洗干净、自然阴干、粉碎过筛后备用。亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、氢氧化钠、柠檬酸钠、盐酸、硝酸铝、盐酸萘乙二胺、无水乙醇、二甲胺、T-萘胺(以上试剂均为分析纯);芦丁标准品,中国医药(集团)上海化学试剂公司(生化试剂)。实验用水均为自制蒸馏水。UV3010型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);WD800B型格兰仕微波炉(佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司);FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);SHZ-D型循环水式真空泵(巩义市荧峪予华仪器厂);ZF-2型三用紫外仪(上海安亭电子仪器厂);722S型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);PL203型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。2.2　2.2.1　总黄酮测定方法原理以芦丁为标准对照品,配制不同浓度梯度,采用硝酸铝显色法运用分光光度计在510nm处测吸光度,得线性回归方程[8]。2.2.2　西番莲果皮总黄酮的提取工艺流程设计及主要影响因子确定提取工艺流程设计为:干燥西番莲果皮粉末(0.5000g)→浸泡(70%乙醇溶液,12h)→微波提取(15min)→离心(5000r/min,10min)→定容(100mL容量瓶)→吸取(1.0mL)→定容(10mL容量瓶)→测定吸光度。通过预实验与单因素实验确定考察的影响因子与取值范围,见表1所示,采用正交试验设计方法对影响因素进行L16(44)研究。2.2.3　西番莲果皮总黄酮提取液抑制亚硝化反应[9,10]2.2.3.1　西番莲果皮总黄酮对亚硝胺合成阻断率的测定在紫外灯照射下,二甲基亚硝胺可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根,其化学反应方程式如下:(CH3)2N—NO+H2O(CH3)2NH+2+NO-2分解出的亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后,再与T-萘胺偶合生成红色化合物,然后采用分光光度计测出该化合物的吸光度,就可知道上述反应液中亚硝胺含量多少。实验时,分别吸取最佳条件下获得的西番莲果皮总黄酮提取液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mL于25mL的容量瓶中。加入10mLpH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液、1.0mLNaNO2溶液(1mmol/L)、1.0mL二甲胺溶液(1mmol/L),用蒸馏水稀释至刻度,在37℃1180光谱实验室第30卷条件下恒温1h。用移液管准确吸取1.0mL上述含NDMA(对亚硝胺)的反应液至7cm2培养皿中,加入质量分数0.5%Na2CO3溶液0.5mL后,于黑布遮盖的紫外分析仪下照射15min,紫外灯离液面约15cm。取出后加入1.5mL质量分数为1%对氨基苯磺酸,再加入1.5mL质量分数为0.1%T-萘胺及0.5mL蒸馏水,摇匀静置15min后。用分光光度计在525nm处测吸光度值(A)。同时用提取剂做空白实验,计算出阻断率:阻断率%=A0-AA×100%式中:A0——未加样品溶液时NaNO2的吸光度(以试剂空白溶液为参比溶液);A——加入样品溶液后NaNO2的吸光度(以样品溶液为参比溶液)。2.2.3.2　西番莲果皮总黄酮对亚硝酸钠清除率的测定亚硝酸钠在弱酸性条件下,与对氨基苯磺酸重氮化,再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色化合物,然后用分光光度计测出该化合物的吸光度,就可知道反应液中亚硝酸钠含量多少。据此可以通过测定相同条件下亚硝酸钠含量的变化反映西番莲果皮总黄酮清除能力的强弱,亚硝酸钠含量少,西番莲果皮总黄酮清除能力就强,反之则弱。分别取最佳条件下提取的西番莲果皮总黄酮提取液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mL于25mL容量瓶中,加入pH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液10mL,再加入50mg/L的NaNO2标准液1.0mL,用蒸馏水定容至刻度,37℃条件下恒温反应1h。然后各吸取1mL反应液至7cm2培养皿中,加入2.0mL质量分数0.4%对氨基苯磺酸溶液,再加入1.0mL质量分数0.2%盐酸萘乙二胺,摇匀静置15min。用分光光度计在540nm处测吸光度值,分别用相应浓度相同用量的提取剂做空白实验,最后计算出清除率:清除率%=A0-AA×100%式中:A0——未加样品溶液时NaNO2的吸光度(以试剂空白溶液为参比溶液);A——加入样品溶液后NaNO2的吸光度(以样品溶液为参比溶液)。3　结果与讨论3.1　按照芦丁对照品浓度梯度与对应的吸光度绘制校准曲线,得到校准曲线的线性回归方程为:y=0.1135A+0.00308(r=0.9995),芦丁质量浓度y在0.0053—0.0424g/L范围内与吸光度A之间有较好的线性关系。3.2　以提取液中的总黄酮提取率为指标,4个影响因子为研究对象,进行L16(44)正交试验,实验数据输入正交设计助手(3.1版本),结果见表1。实验结果表明,4种考察因素对西番莲果皮总黄酮提取效果影响的主次顺序依次:乙醇体积分数微波功率料液比微波提取时间。由表知最佳组合1181第3期冯纪南等:西番莲果皮总黄酮提取工艺及抑制亚硝化反应为A2B3C2D2,即乙醇体积分数60%、料液比1∶40(g/mL)、微波提取时间15min、微波炉功率400W。在此最佳提取工艺条件下进行6次平行实验,结果得到西番莲果皮总黄酮的平均提取率为57.03mg/g。1　L16(44)试验号A乙醇体积分数(%)B料液比(g/mL)C微波时间(min)D微波功率(W)总黄酮提取率(mg/g)11(70)1(1∶60)1(20)1(500)6.0521(70)2(1∶50)2(15)2(400)6.5331(70)3(1∶40)3(10)3(300)6.9141(70)4(1∶30)4(5)4(250)8.0552(60)1(1∶60)2(15)3(300)48.8062(60)2(1∶50)1(20)4(250)54.0972(60)3(1∶40)4(5)1(500)50.3382(60)4(1∶30)3(10)2(400)55.1793(50)1(1∶60)3(10)4(250)40.05103(50)2(1∶50)4(5)3(300)42.56113(50)3(1∶40)1(20)2(400)47.73123(50)4(1∶30)2(15)1(500)44.27134(40)1(1∶60)4(5)2(400)19.65144(40)(1∶50)3(10)1(500)16.48154(40)3(1∶40)2(15)4(250)21.89164(40)4(1∶30)1(20)3(300)13.40k127.54114.55121.27117.13k2208.39119.66121.49129.35k3174.61126.86118.61111.67k471.42116.71120.59124.08R180.8512.312.8817.683.3　按2.2.3.1节方法,研究最佳提取工艺条件下得到的西番莲果皮总黄酮提取液加入量对亚硝胺合成的阻断作用,结果如图1所示。由图1可见,随着西番莲果皮提取液用量的逐渐增加,西番莲果皮黄酮类化合物对亚硝胺合成的阻断效果随之上升,当用量超过一定值后,阻断率又开始缓慢下降。当提取液加入量为1.0—3.0mL提取液时,阻断率上升极快,由15%左右跃迁到70%以上;而当用量达到3mL以后,继续增大用量,阻断率提高缓慢,曲线趋于平缓。实验中最大阻断率出现在西番莲果皮提取液用量1182光谱实验室第30卷为4.0mL处,结果可达80.8%,说明西番莲果皮在防癌领域具有良好的应用前景。3.4　按2.2.3.2节方法,研究最佳条件下得到的西番莲果皮提取液加入量对亚硝酸钠的清除率,实验结果如图2所示。由图2可知,西番莲果皮总黄酮提取液对NaNO2的清除率最大可达73.0%,说明西番莲果皮总黄酮提取液可有效地清除亚硝酸钠。图中实验结果还表明,西番莲果皮总黄酮提取液对亚硝酸钠的清除率随着加入量的增加而增大,但当提取液加入量达到4.5mL后,进一步增加提取液的量,清除率趋于平缓,甚至弱有下降。4　结论(1)微波辅助提取西番莲果皮中总黄酮的最佳提取工艺条件为:乙醇体积分数为60%、料液比为1∶40、微波辐射提取时间为15min、微波炉功率控制为400W,在此条件下总黄酮的提取率可达57.03mg/g。(2)在模拟人体胃液的条件下,西番莲果皮黄酮类化合物能有效地阻断亚硝胺的合成和清除亚硝酸盐,最大阻断率可达80.8%,最大清除率可达73%。(3)西番莲果皮原料易得,作为食品保健品和防癌剂开发利用前景可观,因此有可能成为一种经济的、有效的、具有防癌作用的天然生物新资源。图1　西番莲果皮总黄酮对亚硝酸胺的阻断率结果图2　西番莲果皮总黄酮对亚硝酸钠的清除率结果参考文献[1]郑文武,郑颂,刘永华.我国西番莲生产现状及