基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量snp检测芯片的研究及应用

东南大学硕士学位论文基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量SNP检测芯片的研究及应用姓名：孙蓓丽申请学位级别：硕士专业：生物医学工程指导教师：陆祖宏20060601基于聚丙烯酰胺凝胶的高通量SNP检测芯片的研究及应用作者：孙蓓丽学位授予单位：东南大学相似文献(10条)1.期刊论文张小燕.左明雪.张占军.王忠.李瑶.ZHANGXiao-yan.ZUOMing-xue.ZHANGZhan-jun.WANGZhong.LIYao用基因芯片检测单核苷酸多态性反应原理-中国生物工程杂志2005,25(11)基因芯片技术因其高通量、高效率的特点被用于第三代遗传标记单核苷酸多态性位点的筛选.近几年SNP芯片研究在反应原理方面取得了重大进展,其中包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于一步法反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白-DNA结合反应的芯片,及基于荧光分子-DNA结合反应的芯片.比较了上述各种芯片技术方法的优劣,为进一步科研工作的开展提供了参照,并综述了SNP芯片在疾病基因组学、药物遗传学和个体识别等科研领域的应用,且对其今后的发展方向进行了阐述.2.学位论文林莉RRM1和mdr1基因单核苷酸多态性及表达的研究2006肺癌是美国癌症相关死亡的第一位原因(超过乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌死亡总数)，占癌症总死亡数的28％。由于缺乏有效的早诊早治手段，初诊肺癌患者中约3／4已失去手术机会，其主要治疗手段为化疗和放疗。进入90年代以来，随着第三代药物健择等的出现，肺癌化疗效果有了一定的提高，但这些第三代药物与铂类联合方案的有效率也才达30％一40％，并且这个水平已达到了一个新的平台阶段。研究显示，一些基因的异常或表达水平增高使肿瘤对化疗药物产生抗药性是影响药效的一个重要因素。实时荧光定量PCR技术和基因芯片技术是近年来发展并逐渐完善的一种程序化、规模化、高通量的基因表达分析与基因检测新技术，为现代生物医学等领域内的研究与探索提供了有力的资料获取与分析的技术平台，在基因检测、基因表达分析、突变检测、SNP筛查以及反义药物的筛选等研究领域得到越来越广泛的应用。本文应用这两种新技术对RRMl和mdrl基因的单核苷酸多态性及表达进行了检测并分析其相关性，期望对肺癌的个体化治疗提供理论依据。第一部分：核糖核苷还原酶M1亚单位基因是健择的分子靶点，它是RNA合成的前体，参与核糖核苷酸还原成脱氧核糖核酸的过程，为DNA修复的限速酶；研究表明，RRMl启动子区域(．)37位点基因的多态性与健择的疗效有关。本章建立了一种简便和特异的对RRMl进行等位基因分型的方法。以RRMl基因为靶合成含突变位点的特异引物：野生型引物WF，突变型引物TF和共同的下游引物R。用DNA嵌入荧光染料SYBRGreenI进行荧光PCR扩增，在PCR后进行溶解曲线分析以确定得到产物的基因型，优化了引物浓度，对其灵敏度进行了分析，对10份PCR产物进行了验证。野生型基因组为模板时，WF和R组合有荧光响应，而TF，R组合无荧光响应；当以突变型基因组为模板时，TF和R组合有荧光响应，而WF和R组合无荧光响应，两者Ct值均为24，Tm值均为89~C。优化引物浓度为0．251xmol／L。PCR产物测序证实荧光PCR法与直接测序结果一致。AA型等位基因的在中国人群中的发生频率为313％。该方法能准确快速地区分RRMl的基因型，其敏感性和特异性强。第二部分：建立了实时荧光定量PCR方法检测健择耐药相关的5种基因(RRMl，PTEN，ERCCl，DCK，CDA)的表达方法，并用内参基因β-actin作对照。对40例肺癌组织和健择耐药细胞A549，H460进行了检测并分析了基因多态性和基因表达的关系。结果表明：RRMl与PTEN，ERCCl的表达有相关性，在40例肺癌组织中，相关系数分别为r=0．54152和0．41928；在健择耐药细胞相关系数分别为r=0．82107和0．95148，而且耐药细胞中RRMl,PTEN,ERCCl表达明显增加，DCK表达降低，CDA表达增加；RRMl的基因型与基因表达量无明显关系。第三部分：制备了mdrl基因分型芯片检测患者的基因型。选取发生频率高的8个SNP位点，设计并合成16条探针，将其点在芯片上，制备完成寡核苷酸芯片。合成4对引物，扩增片段中包含SNP位点。构建野生型和突变型质粒，以其为模板经PCR仪扩增后，与芯片上的探针杂交，并用扫描仪分析结果。成功构建了野生型和突变型质粒，与芯片杂交能很好地区分基因型，优化了制备条件，将杂交时间定为60min，杂交温度定为42~C。建立了分型标准。对40例肺癌患者进行了基因分型，并对10份PCR产物进行了测序验证。结果显示该基因芯片是一种快速特异准确的基因分型方法。第四部分：建立了检测mdrl基因表达的实时定量PCR方法，对临床标本进行了检测，并对基因型和表达的关系进行了分析。制定了内参和目的基因的标准曲线。40例手术病人的基因型和表达分析表明，2677TT型和3435TT型患者肿瘤组织mdrl基因的表达低于野生型患者，而其它SNP位点的多态性与基因表达无明显关系。对95-C，95-D两株细胞株的表达检测发现95-D细胞中mdrl基因的表达明显高于95-C细胞株，对泰素，泰索帝，诺维本的细胞毒作用明显弱于95-C细胞株，它的基因型为3435CC，而95一C细胞的基因型为3435TT。总之，实时荧光定量PCR法和基因芯片方法，能够很好地对临床标本的基因型进行检测，费时短，灵敏度高。实时荧光PCR方法还可以对基因的表达进行检测，对于RRMl基因，它RRMl(-)37位点的基因型与表达无明显关系，RRMl基因与PTEN，ERCCl基因的表达有相关性；而对于mdrl基因，2677，3435位点的基因型与基因的表达相关，野生型患者mdrl基因的表达高于突变型患者。3.期刊论文王宁.金泰廙基因芯片技术在金属毒理学中单核苷酸多态性研究的应用-环境与职业医学2004,21(4)基因芯片这一技术方法在1991年在Science杂志上被首次提出[1]，其高度并行性、高通量、微型化和自动化的特点适应了分析人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)所提供的海量的基因序列信息的需要.4.学位论文杨耀基于基因芯片方法的孤独症和SNP相关性分析2006单核苷酸多态性(SNP)是几种最为重要的基冈多态性之一，个体间SNP的差异影响了人们罹患疾病的不同风险和埘药物的不同反应。因而研究SNP位点与疾病相关性对于多基因疾病的诊断和治疗有着重要的意义。孤独症是一种严重的广泛发育障碍，迄今为止，孤独症的病因及发病机制尚小清楚。近年来，孤独症双生予及家系研究结果证实遗传因素在其发病中起着重要的作用，遗传的可能性高达90﹪，是一种与多基因相关的疾病。近年来，关于疾病与基冈多态性的相关性的研究越来越多，充分说明了该类研究是后基因组时代的一个热点问题。然而，该类研究对SNP进行基因分型的重复工作最很大。基于基因芯片技术的SNP检测方法的出现为样本处理提供了一条捷径。本论文在总结调研已有的基于基因芯片技术的SNP检测方法的基础上，对基因芯片高通量的检测能力做了进一步的探索，在样奉制备阶段引入了加端PCR、多重PCR、不对称PCR等非常规PCR扩增手段，初步探讨了芯片对多样本多SNP化点同时检测的方法。建立了仞步的用于多样本多SNP位点同时检测的方法流程。本文的另一个内容是调研了关于孤独症与多个候选基因相关性研究的工作，利用基于基因芯片的多样本多位点SNP检测方法对82个孤独症核心家系进行了RELN基因上3个SNP位点的基因分型，利用传递不平衡(TDT)检测算法，研究孤独症和位于RELN基因上的这3个SNP的相关性。5.期刊论文王娟.倪虹.陈力.刘岩雪.陈成彬.宋文芹肝癌相关基因单核苷酸多态性基因芯片制备与检测分析-中华检验医学杂志2004,27(10)目的研制肝癌多种相关基因芯片,进行肝癌组织中基因编码区单核苷酸多态性(cSNP)检测分析研究.方法选取定位于肝癌高频缺失区的基因,经NCBIdbSNP数据库查询,获得基因cSNP序列,且根据多态位点设计寡核苷酸探针,制备成含25个肝癌相关基因的48个cSNP芯片.并对10例肝癌患者cSNP进行检测分析,而对7例患者的部分检测结果用聚合酶链反应-单链构象多态性法(PCR-SSCP)和测序进行验证.结果芯片检测的灵敏度为6×10-3ng/μl,检测重复率高于95.83%,随探针浓度降低,杂交信号逐渐减弱.10份肝癌患者组织中,检测到半胱氨酸酶caspase9(rs2308941)C→T多态性和停泊蛋白DOK2(rs2242241)T→G各7份,表皮生长因子类似物EGFL3(rs947345)A→G多态性、caspase9(rs2308938)C→G多态性和磷酸甘油酸盐脱氢酶PHGDH(rs1801955)T→A多态性各6份,启动子结合因子E2F2(rs3218170)G→A多态性5份,DNA切除修复糖基化酶MUTYH(rs1140507)T→C和胞内蛋白BNIP3L(rs1055806)G→T多态性4份,肿瘤坏死因子家族成员TNFRSF1B(rs1061622)T→G多态性1份.经PCR-SSCP检测,7例肝癌患者有多态性单链迁移率改变.选取有caspase9(rs2308941G)与(rs2308941A)的样本分别连接pBS-T载体,转化DH-5α菌株,挑取的阳性克隆测序结果证实,该基因中有多态位点A的存在.结论成功制备了肝癌相关基因cSNP基因芯片,为肝癌多态性标记的检测奠定了基础.6.学位论文谈峥精神分裂症的分子遗传学研究及单核苷酸多态性基因分型芯片技术的建立2002精神分裂症(Schizophrenia)是以基本个性改变,思维、情感、行为的分裂,精神活动与环境的不协调为主要特征的一类精神疾病.大量的双生子、寄养子和家系研究的数据表明在精神分裂症的发病过程中遗传因素有很重要的作用,所以精神分裂症作为一种复杂遗传疾病被纳入遗传学的研究范畴.要找出精神分裂症的致病基因,需要在同临床实践紧密结合,进行准确诊断和表型分类的基础上,大力发展定位克隆的方法.其中人类基因组中的单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms,SNPs)是一种重要的工具.对于精神分裂症等复杂遗传疾病研究,大规模的SNPs基因分型技术是非常重要的.基因芯片因其密度高,通量大,适合用于建立SNPs基因分型技术.我们对SNPs基因分型芯片技术进行了研究.7.期刊论文林连捷.谭明旗.郑长青.刘香.金玉.林艳.LINLian-jie.TANMing-qi.ZHENGChang-qing.LIUXiang.JINYu.LINYan应用高密度单核苷酸多态性芯片分析胰腺癌细胞基因缺失-中国医科大学学报2008,37(3)目的探索胰腺癌癌变过程中的基因异常,研究胰腺癌基因组的纯合性缺失.方法应用高密度单核苷酸多态性芯片.检测17种胰腺癌细胞株基因组的纯合性缺失,并利用分析软件进行数据分析,用PCR验证纯合性缺失位点.结果17种胰腺癌细胞基因组中,发现70个区域纯合性缺失,其中28个区域无已知基因,42个区域有基因.35个区域经过PCR验证.29个区域经证实为纯合性缺失,芯片的准确度为82.9%,其中最小缺失区域为6kb.结论应用高解析度的SNP基因芯片可以检测胰腺癌全基因组范围内的精细的纯合性缺失位点.8.学位论文郑远卓基于凝胶固定技术基因芯片的优化及其在孤独症SNP研究中的应用2008孤独症谱障碍(ASDs)是一种是由遗传和非遗传因素共同造成的广泛发育障碍综合征，一般在3岁之前发病，主要特征表现为以下3个方面的行为异常：1)社会交往障碍；2)语言交流技巧障碍：3)重复刻板的动作和单一兴趣。遗传因素对儿童孤独症影响很大，一些研究资料表明，与脑部发育或调控神经分化相关基因的缺陷是该疾病的影响因素之一。另一方面，随着人类基因组序列的绘制