基因工程药物研发的基本过程

基因工程药物研发的基本过程基因工程药物的研发分为上游和下游两个阶段：上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。血管抑制素(angiostatin,简称AGN)是纤溶酶原的一个酶解片段,相当于其1～4Kringle区,具有抑制内皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑制因子[1,2],对于控制肿瘤、糖尿病视网膜病变、消化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研究价值和应用前景.PCR产物的T载体克隆（一）重组T质粒的构建一．原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。TaqDNA酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pGEM-TEasyVector末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。二．材料与方法1材料外源DNA片断2仪器、用具移液枪、碎冰3试剂pMD18-TVector；Ligationbuffer；T4ligatease；rATP4方法连接体系如下：16℃连接过夜。（二）重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定1材料E.coliJM109菌株2仪器、用具超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器3试剂(1)CaCl2、LB平板（见附录）；SOC培养基（见附录）；SOB培养基(2)RNaseA1；BufferS1；BufferS2；BufferS3；BufferW1；无水乙醇的BufferW2a(3)1×电泳缓冲液（TAE）；溴化乙锭溶液（EB）[有毒，小心]；琼脂糖；6×加样缓冲液(4)酚；氯仿；异戊醇(5)ddH2O；10×PCRBuffer(Mg2+plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRarTaq酶4方法1.大肠杆菌感受态细胞的制备(1)取大肠杆菌JM109保存液50μl，接种于4mlLB（或SOB）液体培养基中，37℃，300rpm振荡培养过夜，第二天取50μl转接到新的4mlLB（或SOB）液体培养基中扩大培养3h至OD600=0.35～0.4，在无菌操作台上取1ml菌液于1.5ml离心管中，冰浴10min。(2)4℃，5000rpm离心2min，去上清液。(3)加入750μl预冷的0.1MCaCl2重悬菌体，冰浴30min。(4)4℃，5000rpm离心2min，弃上清液。(5)加入100μl冰冷的0.1MCaCl2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4℃保存备用。2.重组DNA的转化(1)将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。(2)于100μl感受态细胞中加入10μl连接产物，冰浴30min。(3)将离心管转入42℃水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将其放在冰上2min。(4)在离心管中加入SOC培养基300μl，枪头混匀，37℃、150rpm温和摇振60min。(5)将200μl转化菌液均匀地涂布于含50mg/mlAmp、20mg/mlX-gal、200mg/mlIPTG的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。注意事项：①制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。②42℃热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。③菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。3．重组质粒的鉴定方案一菌落PCR(1)制备PCR混合液：(2)用经灭菌的10μl枪头（不用牙签）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中(3)盖上离心管得盖子，在沸水上温育10min。(4)将步骤⑶的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRarTaq酶0.25ul。(5)按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。(6)取5μlPCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。方案二质粒PCR1.碱裂解法少量制备质粒DNA(1)用离心管收集4ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。(2)用250μl已加入RNaseA1的BufferS1充分悬浮细菌沉淀。(3)加入250μlBufferS2，温和但充分地上下翻转混合4-6次，此步骤不宜超过5min。*BufferS2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。(4)加入400μlBufferS3，温和地上下翻转8-10次，室温静置2min，14000rpm离心10min。*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3min。(5)将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prepTube中，5500rpm离心1min。(6)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm离心1min。(7)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700μl已加无水乙醇的BufferW2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。(8)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，14000rpm离心1min。(9)连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prepTube置于一新的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入25-30μlEluent或去离子水。(10)室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱DNA。(11)取5μL样品，1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。2.抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。(1)加TE稀释质粒DNA溶液至300μL。(2)加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），震荡混匀，静置3min。(3)14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），混匀，静置3min。(4)14000rpm离心5min，吸上清液，加等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，静置3min。(5)14000rpm离心5min，吸上清液，加2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，沉淀质粒DNA。(6)14000rpm离心13min，弃上清液，沉淀加入200μL70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用20μL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀，-20℃保存待用。(7)取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。3.质粒PCR(1)PCR反应体系如下：(2)PCR扩增反应条件：94℃预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min；循环结束后72℃再延伸5min。(3)取5μlPCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，方法与试验二相同。PCR产物克隆大致分为两类，平滑末端连接和粘性末端连接，平滑末端比粘性末端的连接效率要低很多。平滑末端连接：载体为平末端，可用EcoRV或SmaI酶切，同时为了防止载体自连，对载体做了去磷酸处理。PCR产物为磷酸化的平末端产物：一般高保真聚合酶扩增得到，高保真聚合酶有很强的3’→5’外切酶活性。或将非平末端的PCR产物使用DNA聚合酶进行平末端处理。对于平末端的PCR产物还需要进行磷酸化处理，使其5’磷酸化。粘性末端连接：1、酶切克隆：在PCR引物的5’端引入与载体匹配，不同识别位点的限制性内酶切位点，载体使用同样的限制性内切酶酶切，进行连接，通常可以得到定向克隆的结果。2、TA克隆：TA克隆系统由Invitrogen公司（SanDiego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。TA克隆没有方向性。聚合酶链式反应科技名词定义中文名称：聚合酶链式反应英文名称：polymerasechainreaction;PCR定义1：用引物和DNA聚合酶进行体外扩增特定的DNA区域的一种技术。所属学科：生态学(一级学科)；分子生态学(二级学科)定义2：体外酶促合成特异脱氧核糖核酸片段的技术。所属学科：水产学(一级学科)；水产生物育种学(二级学科)定义3：通过DNA互补双链解链、退火和聚合延伸的多次循环来扩增DNA特定序列的方法。所属学科：细胞生物学(一级学科)；细胞生物学技术(二级学科)定义4：由穆利斯(K.B.Mullis)于1988年首创的一种在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术。所属学科：遗传学(一级学科)；分子遗传学(二级学科)本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布目录[隐藏][概述]［PCR原理］[PCR反应体系与反应条件]［PCR步骤］［PCR检测］［PCR反应特点］［PCR的循环参数］[PCR仪器][概述]［PCR原理］[PCR反应体系与反应条件]［PCR步骤］［PCR检测］［PCR反应特点］［PCR的循环参数］[PCR仪器]PCR实验室的建立方法[编辑本段][概述]聚合酶链式反应(Polym