植物组织培养实验之具体配置

植物组织培养实验实验一培养基贮备液（母液）的配制•目的与要求：熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法.•实验步骤：称量分别溶解混合定容。一，MS培养基的组成1、大量成分→贮备液Img/LNH4NO31650KNO31900CaCl22H2O440MgSO47H2O370KH2PO4170配制20倍浓度贮备液500mL.2、微量成分→贮备液IImg/LKI0.83H3BO36.2MnSO44H2O22.3ZnSO47H2O8.6Na2MoO42H2O0.25CuSO45H2O0.025CoCl26H2O0.025•配制100倍浓度贮备液100mL.3、铁→贮备液IIImg/LFeSO47H2O27.8Na2EDTA2H2O37.34、有机成分→贮备液IVmg/L肌醇100烟酸0.5盐酸硫胺素(VB1)0.1盐酸吡哆醇0.5甘氨酸2•配制100倍浓度贮备液100mL.•配制100倍浓度贮备液100mL.二，常用生长调节剂•6-BA：1mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。•NAA:1mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。三、作业：•（一）一般可将MS培养基分为哪四个部分？分别含有几种试剂？各种试剂的浓度（mg/L）如何？•（二）如需配制MS培养基的20×的贮备液I量为500mL、100×的贮备液II、III和IV各100mL以及BA和NAA（浓度为1mg/mL）各50mL，则应分别称取多少量的各种试剂？注意要点有哪些？贮备液I(g)贮备液III(mg)MgSO47H2O3.70500mFeSO47H2O278100mLNH4NO316.5Na2EDTA2H2373CaCl22H2O4.40生长调节剂KNO319.06-BA50m50mLKH2PO41.70NAA50m50mL贮备液II(mg)贮备液IV(mg)KI8.3100mL肌醇1000100mLH3BO362烟酸5MnSO44H2O223盐酸硫胺素1ZnSO47H2O86盐酸吡哆醇5Na2MoO42H2O2.5甘氨酸20CuSO45H2O0.25称量溶解混合定容CoCl26H2O0.25实验二固体培养基的配制与灭菌一、实验目的：学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法。二、实验步骤：称量混合调pH值灭菌•称量：按每瓶培养基终体积50mL计，称取适量的琼脂（常用量8g/L）和蔗糖（常用量30g/L），置于大烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积的3/4左右，（加热）使之溶解。•混合：分别加入一定量的贮备液I、II、III、IV和生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏水直至需配培养基的终体积。•调pH值：充分混合后，在60℃水浴条件下用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl调节培养基的pH值至5.8。•灭菌：封严培养容器口后，120℃灭菌20min后，将培养基取出，置于水平台子上，在室温下冷却，备用。实验三外植体材料的预处理、消毒及接种•一、实验目的：熟悉外植体材料的预处理，掌握其消毒和接种方法。二、方法步骤：（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物材料清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。（二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100ml水）等浸洗上述植物材料约5min，再用自来水冲净洗衣粉水。这是进一步减少污染的处理。同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。•（三）将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30min后关掉紫外灯。•（四）操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。（五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100mL消毒液滴加10~15滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5cm），开始计算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无菌水为止。无菌水的清洗时间每次约3min；清洗5次。（七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。如有必要，也可再行切分。在完成切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。（八）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能带有的微生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于超净工作台的适当位置。（九）在完成了该第一只培养容器的外植体接种操作后，用70%乙醇对超净工作台的台面进行擦拭灭菌，接着再进行第二只培养容器的外植体接种及超净台台面的灭菌，直至全部完成。三、作业：•练习无菌操作；统计植物材料表面灭菌结果；分析污染原因；提出减少或避免污染的措施。实验四枝芽增殖培养基的设计与配制一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养基的设计、配制方法。二、方法步骤：（一）称取4g琼脂和15g蔗糖，加蒸馏水至需配培养基终体积500mL的3/4，加热使之溶解，并在80℃热水浴中保温。（二）分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV及NAA0.25mg，然后1~5各小组再分别加入各自不同量的BA（0.25；0.5；0.75；1及1.5mg）。（三）充分混匀后，用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl调节培养基的pH至5.8。定容至500mL。（四）将培养基分装到所选用的培养容器中，每个容器的装量不超过其最大容量的1/3。拧紧瓶盖。（五）将装有培养基的培养容器置高压灭菌器中高压灭菌（120℃，20min）。灭菌结束后从高压灭菌器中取出，置于平台上冷却，备用。三、作业：•在进行枝芽增殖培养基设计时，应注意哪些问题？实验五枝芽增殖培养的外植体的处理与接种•一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养外植体的处理、接种方法。二、方法步骤：•（一）将经湿热灭菌装有培养基的培养容器、接种用具等置于超净台上，打开超净台的紫外灯，灭菌处理30min。•（二）操作人员坐到超净台前，用浸有70%酒精的棉球擦超净台面、操作者手等部分。•（三）点燃酒精灯，从装有无菌苗的培养瓶中取出无菌苗，置于无菌的培养皿中的无菌滤纸上，用灭过菌的刀和镊子配合操作，从叶柄处切下，将所有叶片去除，只留下近茎部的一小段叶柄。•（四）将去除叶片后的茎，切分成带腋芽的茎段。•(五）打开培养容器盖子，将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，盖好培养容器盖子，置于超净台上适当位置。对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。如此操作，直至完成。三、作业：•进行增殖试验结果的观测、比较、记录和分析。实验六根再生诱导培养基的设计与配制一、实验目的：学习、掌握根再生诱导培养基的设计、配制方法。二、方法步骤：•（一）称取4g琼脂和15g蔗糖，加蒸馏水至需配培养基终体积•500mL的3/4，加热使之溶解，并在80℃热水浴中保温。•（二）分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV，然后1~5各小组再分别加入各自不同量的NAA（0.25；0.5；0.75；1及1.5mg）。•（三）充分混匀后，用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl调节培养基的pH至5.8。补加蒸馏水至培养基的终体积500mL。•（四）分装后，将装有培养基的培养容器置高压灭菌器中高压灭菌（120℃，20min）。•（五）将灭过菌的装有培养基的培养容器从高压灭菌器中取出，置于平台上冷却，备用。三、作业：•在进行根再生诱导培养基设计时，应注意哪些问题？