大肠癌多药耐药逆转的研究进展

耀阔专利网收集整理万医学期刊论文,免费配方,行业技术以及15万各行业标准免费下载,详情访问大肠癌多药耐药逆转的研究进展作者：王开雷,李乐平,靖昌庆单位：山东大学附属省立医院普通外科(山东济南250021)【摘要】大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其多药耐药的发生是多因素、多阶段、多步骤共同作用的结果，针对其多药耐药逆转的研究对于提高患者的远期疗效极其重要。目前针对其多药耐药逆转机制的研究主要有针对P-糖蛋白的逆转、基因治疗、中医中药治疗等。在上述领域的研究已经取得了一定的进展，如何进一步深入研究大肠癌多药耐药的发生、发展机制，并实现多药耐药的逆转，将有助于预测和改善化疗疗效、提高消化道恶性肿瘤的综合疗效，并最终克服多药耐药这一难题。【关键词】结直肠肿瘤·化学治疗·抗药性，多药·逆转在西方国家大肠癌病死率仅次于肺癌和乳腺癌，居恶性肿瘤死亡的第3位[1]，在我国占全国恶性肿瘤死因的第5位，而且发病率呈逐年升高趋势[2]。大肠癌虽然以手术治疗为主，但对于晚期及术后复发患者，化疗则是主要的治疗手段。但目前化疗疗效并不理想，多药耐药(multidrugresistance，MDR)的产生，特别是大肠癌细胞的MDR原发性高表达及继发性高表达，是大肠癌化疗疗效明显降低的主要原因之一。MDR的特点是一旦对某种化疗药物产生耐药，则对结构、细胞作用靶点和作用机制均不同的抗癌药物都会产生交叉、广谱耐药现象[3]。现在研究发现，蛋白激酶C(proteinkinasesC，PKC)活性的增强在MDR发生中起着关键作用，PKC可能通过MDR1基因和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)发生作用[4]。与此同时大肠癌MDR呈现多种机制，还可能同时存在谷胱甘肽-S转移酶(GST)、拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)/MDR相关蛋白基因(MDR-associatedproteingene，MRP)等机制，因此如何逆转MDR成为提高大肠癌远期疗效的关键。将近年来大肠癌MDR方面的逆转研究进展综述如下。1针对P-gp的逆转P-gp是由1280个氨基酸构成的跨膜蛋白，通过激活ATP泵，阻碍药物向细胞内被动扩散，将细胞内诸如阿霉素、长春新碱等细胞毒药物向膜外主动转运，降低细胞内药物浓度，从而产生MDR作用。编码P-gp的基因为MDR1，人类MDR1基因表达与MDR表型有关。体外研究表明，MDR1基因与P-gp表达水平越高，MDR细胞内药物浓度越低，则耐药性越强[5]。目前对阻断此机制的逆转药研究较多，主要有以下几种。1.1钙拮抗剂钙拮抗剂可竞争性与P-gp结合，通过充当耐药细胞外排泵的竞争性底物以增加细胞内药物的积聚量来实现逆转作用[6-8]、钙拮抗剂的拮抗活性与其MDR逆转作用无关，而与心血管系统毒性有关，后者严重妨碍其临床应用。早在20世纪80年代末，人们就发现肿瘤细胞内钙调素(calmodulin，CaM)含量高于正常细胞，钙调素拮抗剂有潜在的DNA损伤和细胞毒作用[9]。Lakshmikuttyamma等[10]用免疫组织化学和Westernblot法发现45例直肠癌患者钙调磷酸酶(calcineurin，CaN，一种CaM依赖的蛋白磷酸化酶)的表达活性明显高于正常人。最近Kahl和Means[11]发现大部分CaM拮抗剂以细胞内CaM/CaM激酶(CaMKinases，CaMK)和CaN等为靶标可以对肿瘤细胞的周期产生抑制效应。Schneider等[12]用免疫抑制剂类CaM拮抗剂环孢霉素(cyclosporine，CsA)在AR42J(一种胰腺癌细胞系)中通过抑制细胞周期素CyclinD1的启动子与转录因子的结合而达到抑制肿瘤细胞的增殖作用。Rodriguez-Mora等[13]在人乳腺癌细胞系MCF-7中导入CaMK的抑制剂NK-93或者特异性的RNA干扰片断(siRNA)后发现通过抑制CyclinD1合成和减弱pRb分子的磷酸化达到对细胞G0/G1期阻滞作用。1.2CsA类在众多的逆转剂中CsA、三苯氧胺(tamoxifen，TAM)对P-gp介导的MDR有较好的疗效，二者同时应用可提高逆转效果，且毒副作用并无重叠[14]。研究表明，MRP为一种ATP依赖的跨膜蛋白，在ATP水解提供能量下可主动将细胞内药物泵出，降低细胞内药物浓度，从而产耀阔专利网收集整理万医学期刊论文,免费配方,行业技术以及15万各行业标准免费下载,详情访问生耐药性[15]。作为逆转剂的CsA使阿霉素逾越了耐药限制，使相同剂量的阿霉素在耐药组及药敏组中达到了相同甚至更高的药效，其作用机制是：CsA可与抗肿瘤药物竞争P-gp结合位点，抑制其跨膜转运泵作用，提高细胞内药物浓度从而逆转耐药性[16]。SDZPSC833(3’-酮基去甲基苏氨酸-1-缬氨酸-2-CsA，PSC833)是环状十一肽的非免疫抑制剂[17]，属CsA类药物，是在CsA的基础上发展起来的第2代耐药逆转剂，具有逆转耐药作用强，毒性作用少的优点[18-19]。1.3雌激素拮抗剂研究表明，雌激素受体(estrogenrecept，ER)-β是类固醇激素受体基因超家族成员之一[20]，在肿瘤的发生发展中ER-β表达缺失，通常被认为是一种肿瘤抑制基因[21]。有报道显示男性大肠癌的发病率和病死率是女性的1.5倍，而绝经后的妇女用雌激素替代疗法可降低大肠癌发病率[22]。最近有研究表明，大肠癌组织中ER-β表达降低是大肠癌发生的关键性分子事件[23]。大量研究报道抗雌激素药TAM可与抗肿瘤药物竞争P-gp上结合位点，使肿瘤细胞无法将药物泵出细胞外，从而增加细胞内药物浓度，达到恢复抗肿瘤药物敏感性的目的[9]。但由于大剂量TAM毒副作用较大，其临床应用受限。托瑞米芬(toremifene,TOR)是由芬兰Famos研究组于1979年研制开发的新一代抗雌激素抗肿瘤药物，是非甾体类三苯乙烯的衍生物，相对分子质量为598，分子式为C26H28NOCLC6H8O7。TOR的抗肿瘤作用机制与TAM相似，可竞争性地与乳腺癌细胞质内的ER结合，形成复合物，进入细胞核内调节mRNA和蛋白质合成，阻止癌细胞的增殖、分化，诱导具有肿瘤抑制作用的生长因子的表达和调节基因诱导的凋亡[24]。2基因治疗基因治疗对肿瘤细胞MDR产生逆转的根本原因是某些基因表达不协调，导致某些与MDR相关的蛋白质和酶上调或下降，从而产生耐药[25]。在基因水平逆转MDR将是解决问题的关键。目前此方面的研究主要集中在MDR1及某些癌相关基因方面。随着基因分子生物学的发展，反义核酸技术、核酶技术、RNA干涉技术及反义RNA技术给耐药逆转提供了新的高效特异性的方法，相比传统的MDR逆转方法有较多优势[26]。2.1核酶核酶是一类具有催化活性的小分子RNA，能特异地与靶RNA分子特定位点结合，进行切割，阻断目的基因的表达，因此，只要明确某一基因的结构，就能设计合成出特异性切割其mRNA的核酶，阻断该基因的表达[27-30]。Wiechen等[31]设计针对c-erbB-2mRNA631位点进行切割的锤头状核酶，重组人腺病毒载体后能显著抑制宫颈癌细胞系中c-erbB-2的表达。Suzuki等[32]将重组人抗her-2/neu的锤头状核酶的腺病毒注射到用乳腺癌细胞系BT-474建立的裸鼠动物模型中，肿瘤的抑制率达到20%。陈瑶和陈誉华[33]将特异性裂解GRP94mRNA翻译起始区的核酶，用脂质体介导的转染方法导入培养的CCL229细胞中，发现细胞生长率显著降低。2.2反义寡核苷酸反义寡核苷酸基因治疗是将反义寡核苷酸片段通过与适宜载体相连接后转染人细胞。反义寡核苷酸进入细胞后通过碱基互补的原则与靶mRNA结合，形成DNA-RNA杂交体，从而启动细胞内RNA酶(如RNaseH等)，迅速将mRNA降解[34-35]，使mRNA的翻译功能减弱或消失，进而不能产生有效的作用蛋白;若设计好的反义寡核苷酸片段直接与mRNA翻译起始位点的碱基形成互补，则还能直接阻断mRNA的翻译，由此来抑制靶基因的表达[36]。李玲等[37]利用MDR1和MRPmRNA翻译起始区的反义寡脱氧核苷酸，经硫代化修饰和脂质体包裹后转染高表达MDR1和MRP的耐药细胞SGC7901/ADM(阿霉素，adriamycin)，SGC7901/ADM对卡铂、紫杉醇等化疗药物的敏感性显著提高。罗华友等[38]的实验结果也证实联合抑制MDR1和MRP基因能更有效地逆转肝癌耐药细胞的耐药表型，癌细胞对ADM和柔红霉素的敏感性分别提高耀阔专利网收集整理万医学期刊论文,免费配方,行业技术以及15万各行业标准免费下载,详情访问了47.8倍和21.6倍。2.3RNA干涉(RNAinterference，RNAi)RNAi是指由短双链RNA诱导的同源RNA降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表现型缺失的现象。Elbashir等[39]在哺乳动物细胞中用siRNA诱导产生了特异性的RNAi，RNAi技术迅速扩展到哺乳动物领域，可以在细胞内形成蛋白复合物，结合并裂解特定的靶mRNA，从而抑制蛋白质的表达[40]。袁保梅和李国栋[41]根据MDR1的基因序列，设计并体外转录合成2条siRNA，用脂质体转染将其导入人胃癌MDRBGC-823细胞内。结果发现BGC-823细胞MDR1mRNA和P-gp表达均显著降低，细胞内Rh123稳态积累量均明显增高;sh-MDR1-特异性siRNA可抑制BGC-823细胞MDR1表达。夏忠胜和朱兆华[42]分别构建含编码#4029MDR1siRNA和#4123MDR1siRNA的质粒载体，并转染COLO/320DM结肠癌MDR细胞，发现稳定转染含编码MDR1siRNA的质粒载体能稳定逆转结肠癌细胞MDR1/P-gp依赖的MDR。2.4反义RNA反义RNA是指能够通过碱基互补与靶RNA(主要是mRNA)特异性结合，抑制靶RNA的功能，从而控制其表达的一类小分子转录物。由于能够选择性地封闭靶基因表达，所以可针对性地选择在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、生长因子和(或)受体以及部分关键酶，通过反义RNA技术特异性进行封闭结合，从而达到治疗目的。陈刚和李世拥[43]应用基因克隆技术，将MDR1反义RNA转染入对氟尿嘧啶(5-FU)耐药直肠癌细胞(8348R)中，封闭正义MDR1的转录和表达，联合应用草酸铂及5-FU共同作用于8348R。结果发现，转染含MDR1反义RNA基因的真核表达载体的质粒后，8348R细胞在5-FU作用下较转染前活性明显下降，转染后细胞出现明显的S期和G2/M期阻滞，细胞凋亡比例显著升高;草酸铂将PC-MDR1质粒对直肠癌细胞的转染效率提高18倍，IC50剂量草酸铂、5-FU联合MDR1反义RNA可大大提高对8348R细胞的杀伤效率，总体杀伤效率可达到75%。3酶抑制3.1抑制谷胱甘肽(Glutathione，GSH)合成酶GST系统是一组多功能药物代谢酶，与细胞内解毒密切相关，许多抗癌药物都是其催化的底物。不少化疗药物因GSH/GST启动细胞内解毒机制而失活[44]。丁硫氨酸亚砜亚胺(buthioninesulfoximine，BSO)为一种人工合成的氨基酸类似物，是GSH合成酶γ-谷氨酰半胱氨基合成酶的抑制剂。人体对许多化疗药如ADM、顺铂、长春新碱、环磷酰胺等都可因GSH水平增高而产生耐药，BSO通过抑制GSH的合成而逆转耐药。研究证实大肠癌MDR细胞系中的GSH/GST较相应敏感细胞系高，这些酶