天然药物化学实验指导

天然药物化学实验指导（供药学药剂专业用）河北医科大学药学院天然药物化学教研室2006年3月前言天然药物化学是运用现代科学理论与技术研究天然药物中化学成分的一门学科，是药学、药剂、药分、中药学等专业及相关专业本科学生必修的专业课，是国家职业药师(中药学)资格考试必考课程。本课程在有机化学、分析化学、有机化合物波谱学、中药学、生药学等课程的基础上，重点讲授天然药物中化学成分的化学结构、理化性质、提取分离方法、结构鉴定、生理活性、天然药物新药开发等方面的基本原理和实验技能，培养学生具有从事天然药物方面的研究、开发和生产的能力，为我国药学事业的发展输送人才。天然药物化学实验是天然药物化学课的重要的、必不可少的组成部分。学习的主要目的是通过实验检验在课堂上所学的理论知识，使学生对理论知识的理解更加深入，掌握得更加牢固；通过实验训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，使学生获得从事天然药物化学科研工作的基本训练；使学生养成严谨的科学态度和良好的科学作风。实验教学的重点是加强学生基本操作技能的训练，要求学生掌握以下技能：（一）提取分离方面1.要求掌握常用的经典方法的原理及操作。其中包括液-固提取法（浸渍、渗漉、回流提取等）、液-液萃取法（简单萃取法、梯度萃取法、逆流分布法）、重结晶法等。2.掌握纸色谱、薄层色谱、柱色谱的原理和基本操作。（二）结构鉴定方面1.化学方法①掌握各类化学成分的一般定性反应在鉴定中的应用；②掌握重要衍生物的制备方法及其在结构鉴定中的应用；③了解重要降解反应的原理及应用。2.光谱方法了解UV、IR、NMR、MS在天然药物化学成分结构测定中的应用。目录实验须知······························································································1实验技能操作规范··················································································2实验一大黄中蒽醌苷元的提取、分离和检识··············································8实验二芦丁的提取、水解；黄酮类化合物与糖类的鉴别·····························10实验三苦参生物碱的提取、分离、鉴别和生物碱的检识·····························15实验四利用纸色谱先导设计法从洋金花中提取分离生物碱··························19实验五一叶萩碱的分离和鉴定······························································23实验六青蒿素的提取、分离和检识······················································25实验七穿心莲内酯的提取、分离、鉴定及亚硫酸氢钠加成物的制备··············26实验八设计性实验·············································································29附录··································································································31实验须知学生要求1、第一次实验前要清点所有仪器，若有缺损则向教师报告并填单补充。以后做实验时如有损坏要立即向教师报告，填单补充并按学校规定比例赔偿。最后一次实验课结束后在教师监督下清点所有仪器。2、每次实验前要求提前预习实验内容，了解实验的原理和操作过程。实验中随时做好记录，在检查仪器装置正确后方可进行实验。实验完毕后认真总结，写好报告，提取纯化所得单体产物包好，交给老师。3、实验中不准做与实验无关的事情，严禁吸烟、饮食、大声喧哗，未经允许不得擅自离开，并应随时注意观察实验异常情况。4、实验结束时，应将实验室清扫干净，门、窗、水、电关好，经老师检查许可后方可离去。实验室须知天然药物化学实验中所用的药品多数是易燃、有毒、腐蚀性、挥发性、刺激性及易爆的药品，实验操作有时在加温加压等情况下进行，需要各种热源、电器或其它仪器，操作不慎易造成火灾、爆炸、中毒、触电等事故。所以应加强安全的责任心，提高警惕，消除隐患，遵守实验规则，避免事故。1．仪器药品都是国家财产，须节约爱护使用；公用物品用完后立即放回原处。2．使用易燃、易挥发及有毒的有机溶剂时，在回流、蒸馏、减压蒸馏等操作过程中，不能明火直接加热，要放沸石；若在加热时发现无沸石则应冷却后再加，防止爆沸冲出。减压系统应装有安全瓶。加液或移液时应停火或远离火源。起封易挥发溶剂瓶盖时，脸面要避开瓶口，慢慢启开，以防气体冲向脸部。3．接触有毒及强腐蚀药品应小心操作，操作后要立即洗手。4．实验中，若涉及有毒或腐蚀性气体产生应在通风橱中进行操作。必要时可戴好防护用具进行工作。在进行易燃性有机溶剂实验时，一定要按照操作规程进行。不可将易挥发、易燃性有机溶剂倒入水槽中，应按老师要求处理，有机废液应倒入废液瓶内。5．实验台上不得放无用的药品仪器。在实验时要做到水槽、仪器、桌面、地上清洁整齐。6．万一不慎着火，要沉着冷静积极抢救，立即切断室内电源和火源，用石棉布将着火部位盖严，使其断绝空气而熄灭；或视火势情况选用适当灭火器材进行灭火。在实验室宜使用二氧化碳灭火器。消防器材，沙箱、石棉布、灭火器等应放在方便固定的地点，不能随意移动，均应处于备用状态。以下为实验室中常发生的事故，应予以特别注意且避免：1．蒸馏或回流加热时，发现未放沸石、未等溶液冷却就补加沸石，结果溶液冲出瓶外而引起火灾。2．蒸馏或回流易燃物或有毒物时，忘记开冷凝水，大量蒸气逸出亦易引起火灾或造成人员中毒。3．蒸馏易燃物时塞子漏气引起火灾。4．用三角烧瓶作减压装置的接收器容易炸裂。5．使用真空干燥器时，用完就直接开干燥器的放气阀，结果使泵内的机油被吸到干燥器中，样品被污染。6．实验室水槽被杂物堵塞。第一部分天然药化实验中常用实验技能操作规程一、圆形（径向）纸色谱技术（一）操作技术及程序1.准备仪器及试剂培养皿、色谱滤纸、毛细管、相关试剂等。2．准备色谱滤纸取直径12.5cm的普通圆形滤纸，将滤纸划分出数个区间（根据所点样品的数目划分区间，滤纸不得折叠），在此色谱滤纸中心处用铅笔轻轻画直径约为1.5～2.0cm的圆，做为点样的起始线。在此圆的中心打一小孔，将一个长方形的滤纸条搓成一个滤纸芯，插在色谱滤纸的小孔中，纸芯与色谱滤纸成直角，纸芯的高度要比培养皿上下合盖后的内部高度稍低。3．点样用毛细管将样品及对照品溶液点在色谱滤纸上所画的圆形起始线上，晾（吹）干。做好标记。4．选择及配制展开剂。5．展开将展开剂适量倒入培养皿中，上下盖好，平衡放置，保持5分钟左右，使其内部达液～气饱和。然后将色谱滤纸小心“扣盖”在培养皿的下皿中，色谱纸保持水平，纸芯保持直立并插入展开剂中，扣好培养皿上盖。展开剂将沿小纸芯向上浸湿，到达色谱滤纸后以一个圆形的湿斑慢慢向四周扩展。在展开剂浸湿色谱纸一定距离（一般接近培养皿边沿）时即可结束展开。将色谱滤纸取出，做好展开剂到达前沿标记，自然晾干或吹干。6．显色根据所测样品性质选择合适的显色方法，观察色斑的位置。7．观察实验结果确定出化合物斑点的位置后，用尺子测量距离，计算比移值（Rf）或与标准品对照。（二）注意事项1．色谱纸小心取放，不要折叠、污染。2．展开剂一定要选择合适，否则样品展开效果差。3．点样量要合适，浓度小则展开后观察不清楚，浓度太大则有拖尾现象。径向纸色谱示意图二、硅胶薄层色谱检识技术（一）操作技术及程序1．准备仪器及试剂色谱缸、TLC专用玻璃板（5cm×20cm）、研钵、薄层用硅胶G、0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液、其它相关试剂等。2．制板①硅胶G-CMC板称取2.5～3g硅胶G放入研钵中，加入约7～9ml的0.5%CMC水溶液（硅胶：粘合剂CMC约1：2~3），混合成均匀的粘稠状溶液，再将其倒在TLC玻璃板上并涂布均匀，然后轻轻颠荡，使硅胶均匀地分布在玻璃板上，形成均匀厚度的硅胶层。水平放置，自然晾干。②荧光薄板称取硅胶GF2542.5～3g，同硅胶G－CMC板法制备。③AgNO3-硅胶板方法一：将AgNO3加入少量水溶解，再加甲醇稀释成10％溶液，把预先制好的硅胶薄层浸入该溶液内约一分钟，取出避光阴干。方法二：在硅胶G中加入一定量10％硝酸银水溶液（代替水）调成糊状铺板，避光阴干。3．活化将自然晾干的硅胶板放于烤箱中，在105~110℃中活化0.5～1.0小时。4．点样在距硅胶玻璃板下端1.5～2cm处用铅笔点样轻轻划一直线，注意不破坏硅胶平面，作为点样起始线。分别用毛细管将样品及对照品溶液点在硅胶板的起始线上，晾(吹)干，做好标记。样品点的直径应在2～3mm，样品点之间的间隔应不少于1cm。5．选择及配制展开剂。6．展开将展开剂适量倒入色谱缸中，将薄板放于色谱缸中（不得浸入展开剂中），盖好上盖，保持15~30分钟左右，使其内部达液-气饱和。然后将硅胶板下端小心慢慢地插入到展开剂中，不要使展开剂浸没点样起始线，上端用玻璃物体支起，盖好上盖。此时将会观察到展开剂沿硅胶板逐渐地向上浸湿（即展开），展开的距离一般为15cm以上。将硅胶板取出，在前沿处作出标记，自然晾干或吹干。7．显色根据样品性质选择合适的显色方法进行样品的显色观察。8．计算比移值Rf及与标准品对照。（二）注意事项1．硅胶板小心取放，硅胶板不要受污染、刮蹭。2．样品的点样量要合适，如果浓度小则展开后观察不清楚；如果浓度太大或点样的点直径过大可能有拖尾现象。如果样品溶液的浓度较低，可用毛细管反复在点样处多点几次。3．展开剂一定要选择合适，否则样品展开分离效果差。.4．荧光硅胶（硅胶-GF254）与硅胶-G的使用方法相同，但不用显色剂，可在紫外灯（254nm）下观察样品展开情况。三、硅胶柱色谱分离技术（一）操作技术及程序1．准备仪器及试剂玻璃色谱柱、铁架台、接收瓶、相关试剂等。Rf值测量示意图2．装柱【湿法】取100～200目的柱色谱用硅胶适量，置于烧杯中，加入适量的有机溶剂，搅拌使硅胶完全湿润并无气泡，然后将硅胶加入到色谱柱中。注意加硅胶时要打开活塞，让硅胶自然下沉，液面保持在硅胶之上，硅胶柱中不得有气泡。加样前，液面高度要保持在5~10mm。【干法】取100～200目的柱色谱用硅胶适量，加入到色谱柱中，（主意要打开活塞）加时不断轻轻敲打色谱柱壁，使硅胶紧密均实。3．加样方法一：一般将样品溶液溶于少量开始的洗脱剂中，制成样品溶液，轻轻注入已准备好的硅胶柱上面，勿使柱面受到扰动，否则影响色谱效果。方法二：如样品不溶于开始的洗脱剂，则将样品溶于挥发性的溶剂（如乙醇、甲醇）中，然后取少量吸附剂与其拌匀，除尽溶剂，再将含有样品的吸附剂均匀地加入到色谱柱的顶端，再覆盖上少量硅胶或脱脂棉、小玻璃球将其压住，以防洗脱时冲乱顶部的拌样硅胶。4．选择及配制洗脱剂。5．洗脱及接收选择好洗脱剂后，放在分液漏斗中，打开活塞慢慢连续不断地滴加在吸附柱上。同时打开色谱柱下端活塞，等份收集洗脱液，流速保持1～2滴/秒，一般先选用洗脱能力弱的溶剂，逐步增加洗脱能力。6．同时配合TLC或其它方法检查接收液。（二）注意事项1．硅胶吸附拌样的比例约为：样品：硅胶=1:1或1:2。2．吸附剂硅胶的使用量比例约为样品：硅胶=1:30~60或1:100(难分离物)。3．洗脱剂的极性选择要合适，否则得不到很好的分离。4．洗脱的速度要合适，一般保持在2~15ml/min。色谱柱分离过程示意图四、离子交换柱色谱分离技术（一）操作技术及程序1．准备仪器及试剂色谱柱、铁架台、接收瓶、相关试剂等。2．预处理（活化）树脂（以强酸型阳离子交换树